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莫西沙星对肺炎支原体肺炎小鼠肺损伤的作用研究

2024-10-08 50 上传者：管理员

摘要：目的探讨莫西沙星（Moxi）下调长链非编码RNA生长抑制特异性基因（lncRNA GAS5）通过非受体型蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信号传导及转录激活蛋白（STAT）信号通路对肺炎支原体肺炎的保护作用。方法将BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、实验组和联合组。模型组、实验组和联合组小鼠用鼻滴肺炎支原体菌液的方法建立肺炎支原体肺炎模型。实验组和联合组腹腔注射100 mg•kg-1莫西沙星治疗；在此基础上，联合组尾静脉注射过表达质粒pc-GAS5,对照组和模型组均腹腔注射等量的0.9%NaCl。用酶联免疫吸附试验法检测小鼠血清中白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6水平，用生化法检测小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）水平，用实时荧光定量聚合酶链反应法检测小鼠肺组织中lncRNA GAS5的表达水平，用蛋白质印迹法检测小鼠肺组织中B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、JAK2和STAT3的表达水平。结果对照组、模型组和实验组血清中IL-1β含量分别为（64.03±14.19）、（254.85±63.79）和（157.46±42.93）pg•mL-1,IL-6含量分别为（22.61±5.01）、（184.14±39.50）和（132.64±25.47）pg•mL-1,SOD活性分别为（50.38±11.75）、（28.17±6.71）和（37.67±8.09）U•mL-1,肺组织中lncRNA GAS5相对表达水平分别为1.00±0.16、3.78±0.69和2.41±0.54;对照组、模型组、实验组和联合组肺组织中Bcl-2蛋白相对表达水平分别为1.00±0.17、0.65±0.14、0.82±0.16和0.62±0.13,磷酸化JAK2/JAK2比值分别为1.00±0.20、4.98±1.01、2.13±0.52和4.21±0.92,磷酸化STAT3/STAT3比值分别为1.00±0.18、3.77±0.78、2.65±0.64和3.49±0.75。模型组的上述指标与对照组相比，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.001）;实验组的上述指标与模型组相比，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001）;联合组的上述指标与实验组相比，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。结论莫西沙星能够有效改善肺炎支原体肺炎小鼠肺组织形态，调节炎症因子水平和氧化应激损伤，可能是通过下调lncRNA GAS5影响细胞凋亡和JAK/STAT通路的蛋白表达来实现的。

关键词：
信号传导和转录激活蛋白
凋亡
肺炎支原体肺炎
莫西沙星
长链非编码RNA生长抑制特异性基因
非受体型蛋白酪氨酸激酶
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肺支原体肺炎是一种呼吸系统常见疾病，主要症状为发热、咳嗽、胸痛等，严重者可造成呼吸困难、心肌炎、脑膜炎等，危及患者生命安全[1]。肺炎支原体肺炎多发于秋冬季节，该病易发于5～15岁儿童，传播途径以呼吸道飞沫为主。由于儿童免疫力低下，病情多偏重，且病情进展相对较快，严重影响儿童身体健康和生活质量[2]。研究发现，长链非编码RNA生长抑制特异性基因(long non-coding RNA growth arrest specific 5,lncRNA GAS5)在肺炎支原体肺炎儿童血清中的表达显著降低，在疾病诊断和严重程度评估中有潜在的应用价值[3]。莫西沙星属于喹诺酮类药物，对流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等引起的肺炎有很好的治疗效果[4]。本研究旨在探讨莫西沙星通过下调lncRNA GAS5改善肺炎支原体肺炎所致肺损伤的作用及其机制。

1、材料与方法

1材料

动物SPF级BALB/c小鼠，鼠龄4～6周，体质量16～20 g,雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物许可证号：SCXK(京)2021-0011。本实验经济南市第四人民医院伦理委员会批准(伦理批号：LL-20230709)。

细菌肺炎支原体菌，购自上海士锋生物科技有限公司。

试剂盐酸莫西沙星氯化钠注射液，规格：每瓶250 mL(莫西沙星0.4 g、氯化钠2.0 g),批号：BJ76169,注册证号：H20140424,德国Bayer AG公司生产。pc-GAS5质粒，上海生工生物工程公司合成。兔抗非受体型蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(phosphorylated JAK2,p-JAK2)、信号传导和转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)单克隆抗体，均为美国CST公司生产；白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均为武汉云克隆公司生产；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒，均为南京建成生物工程研究所生产。

仪器DYCZ-40电泳仪，北京六一仪器厂产品；7300实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，美国ABI公司产品；Eclipse E100正置光学显微镜，日本尼康公司产品；Multiskan MK3酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司产品。

2实验方法

2.1模型构建、动物分组与给药方法

将BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、实验组和联合组，雌雄各半。模型组、实验组和联合组小鼠用乙醚进行轻度麻醉，然后从鼻部滴入浓度为1×10 CCU·mL-1的肺炎支原体菌液50μL,对照组滴入等量0.9% NaCl,连续3 d。通过对小鼠进行支原体核酸检测，阳性者即为造模成功。造模成功后第2天开始，实验组和联合组小鼠每天2次腹腔注射100 mg·kg-1莫西沙星，对照组和模型组均腹腔注射等量0.9% NaCl,连续2 d;联合组小鼠尾静脉注射100 nmol·mL-1GAS5-pc质粒，每组20只。

2.2样本采集与处理

实验结束后，记录各组小鼠体质量，用摘眼球法收集小鼠血液，然后用脊椎脱臼法处死，收集肺组织。每组各取10只小鼠双侧肺组织并称质量，计算肺指数(肺指数=肺质量/体质量)和肺湿干比[肺湿干比(%)=(湿质量/干质量)×100%]。其余小鼠左侧肺组织于4%多聚甲醛溶液中固定用于制作组织切片，右侧肺组织于-80℃冷冻保存用于检测相关指标。

2.3苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法检查小鼠肺组织形态[5]

将固定好的小鼠肺组织样本以梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋后置于切片机上切成厚度约4μm的薄片，60℃烘箱烤片，脱蜡处理后用HE染液进行染色，中性树脂封片。

2.4 ELISA法检测小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量[6]

严格遵照试剂盒用说明书进行操作，用ELISA法检测各组小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

2.5生物化学法检测小鼠血清中MDA含量以及SOD和GSH-Px活性[7]

严格遵照试剂盒用说明书进行操作，用生物化学法检测小鼠血清中MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。

2.6实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织中lncRNA GAS5的表达水平[3]

用Trizol试剂对小鼠肺组织中的总RNA进行提取，然后通过逆转录试剂盒合成cDNA。用PCR基因扩增仪进行扩增，扩增体系为95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 59℃退火30 s, 72℃延伸40 s,共扩增35个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参，用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。

2.7蛋白质印迹法检测小鼠肺组织中Bax、Bcl-2、JAK2和STAT3的表达水平[8]

小鼠肺组织样本滴加RIPA裂解缓冲液，充分碾磨后于冰浴中裂解30 min,用BCA法检测小鼠肺组织中的总蛋白浓度。以GAPDH作为内参蛋白进行凝胶电泳实验，电转移至PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭2 h。用一抗于4℃条件下孵育过夜，然后用HRP二抗于室温摇床孵育2 h。将ECL显影液滴加于PVDF膜上进行化学发光，直至条带反应显著。

3统计学处理

用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间比较用两样本均数t检验。

2、结果

1莫西沙星对MP小鼠肺组织形态学的影响

模型组、实验组和联合组小鼠用鼻滴肺炎支原体菌液的方法建立肺炎支原体肺炎模型。实验组给予100 mg·kg-1莫西沙星，联合组100 mg·kg-1莫西沙星+100 nmol·mL-1GAS5-pc质粒，对照组和模型组均给予等量0.9%NaCl。

如图1所示，模型组与对照组比较，小鼠肺组织充血水肿，肺泡结构破坏严重，肺泡壁显著增厚，同时伴有炎症细胞浸润；实验组与模型组比较，小鼠肺组织病变得到缓解，充血水肿现象减轻，炎症细胞浸润减少。

2莫西沙星对MP小鼠肺指数和湿干比的影响

对照组、模型组和实验组的肺指数分别为0.67±0.21、1.73±0.41和1.10±0.29,肺湿干比分别为(4.35±1.06)%、(7.02±1.84)%和(5.24±1.57)%,模型组的上述指标与对照组比较，实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1各组小鼠肺组织苏木精-伊红(HE)染色(×200)

3莫西沙星对MP小鼠血清中炎症因子和氧化应激指标的影响

模型组与对照组比较，小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量均显著上升(均P<0.001),SOD和GSH-Px活性均显著下降(均P<0.001);实验组与模型组比较，IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量均显著下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),SOD和GSH-Px活性均显著上升(P<0.05,P<0.001)。结果见表1。

4莫西沙星下调MP小鼠肺组织中lncRNA GAS5的表达水平

对照组、模型组和实验组小鼠肺组织中LncRNA GAS5相对表达水平分别为1.00±0.16、3.78±0.69和2.41±0.54。模型组与对照组比较，小鼠肺组织中LncRNA GAS5相对表达水平显著上升(P<0.001);实验组与模型组比较，lncRNA GAS5相对表达水平显著下降(P<0.001)。

5莫西沙星通过下调lncRNA GAS5对凋亡相关蛋白的影响

对照组、模型组、实验组和联合组肺组织中Bax蛋白相对表达水平分别为1.00±0.19、4.16±0.92、2.88±0.67和3.75±0.80,Bcl-2蛋白相对表达水平分别为1.00±0.17、0.65±0.14、0.82±0.16和0.62±0.13。模型组与对照组比较，小鼠肺组织中Bax蛋白相对表达水平显著上升(P<0.001),Bcl-2蛋白相对表达水平显著下降(P<0.001);实验组与模型组比较，Bax蛋白相对表达水平显著下降(P<0.01),Bcl-2蛋白相对表达水平显著上升(P<0.05);联合组与实验组比较，Bax蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达水平显著下降(P<0.01),见图2。

表1各组小鼠血清中炎症因子和氧化应激指标水平的比较

6莫西沙星通过下调lncRNA GAS5对JAK/STAT信号通路的影响

对照组、模型组、实验组和联合组肺组织中p-JAK2/JAK2比值分别为1.00±0.20、4.98±1.01、2.13±0.52和4.21±0.92,p-STAT3/STAT3比值分别为1.00±0.18、3.77±0.78、2.65±0.64和3.49±0.75。模型组与对照组比较，小鼠肺组织中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均显著升高(均P<0.001);实验组与模型组比较，小鼠肺组织中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均显著降低(均P<0.01);联合组与实验组比较，小鼠肺组织中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均显著升高(均P<0.05)。

图2各组小鼠肺组织中凋亡相关蛋白的表达

3、讨论

肺炎支原体肺炎属于良性、自限性疾病，临床治疗常选用大环内酯类抗生素，具有良好的疗效[9]。然而，近年来，肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药性逐渐增加，越来越多的患者在用药后仍会出现持续发热、咳嗽等症状，影像学检查也未见改善，甚至加重，如果没有得到及时有效的治疗，可能会发展为难治性肺炎，或出现肺外症状威胁患者的生命健康[10]。

肺炎支原体肺炎的发生发展与多种炎症细胞因子有关，一方面，肺炎支原体肺炎疾病过程中一些细胞因子的表达量会发生变化；另一方面，细胞因子的异常表达可能影响肺炎支原体肺炎的发生和转归[11-12]。此外，在肺炎支原体肺炎过程中，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶不足，过氧化氢和超氧化物等基团进入呼吸道上皮细胞，过度的氧化应激导致呼吸系统的细胞损伤，呼吸道上皮细胞肿胀、坏死[13]。本研究结果发现，莫西沙星能够有效改善肺炎支原体肺炎小鼠肺组织的病理学形态，缓解机体内炎症反应和氧化应激损伤。

研究表明，lncRNA GAS5在气道炎症等功能方面发挥着关键的调控作用，能够有效抑制机体的炎症反应，促进支气管上皮细胞的增殖[14]。Bcl-2是线粒体膜蛋白，可以阻止细胞凋亡的发生；Bax蛋白与Bcl-2形成异源二聚体，作为细胞凋亡激活剂而发挥作用[15]。JAK/STAT信号通路是一条高度保守的信号转导通路，介导细胞外细胞因子、生长因子信号与胞内基因的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症、免疫等生物学效应。IL-6作为一种促炎细胞因子，在机体的抗感染免疫反应中发挥重要作用。IL-6可以通过与相应受体结合诱导JAK磷酸化，促使STAT3的表达增加，激活后的STAT3能够进一步调节下游细胞因子的表达，从而导致炎症的发生[16]。本研究结果表明，莫西沙星可以通过下调lncRNA GAS5抑制肺炎支原体肺炎小鼠肺组织细胞凋亡和JAK/STAT信号通路的激活。

参考文献:

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文章来源:郭晓华,祝伟,张倩.莫西沙星对肺炎支原体肺炎小鼠肺损伤的作用研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(19):2853-2857.