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多种技术在1例嵌合型环状X染色体胎儿产前诊断中的联合应用

2023-10-27 108 上传者：管理员

摘要：目的利用多种技术对1例孕妇无创产前检查提示X染色体数目偏少的胎儿进行细胞及分子遗传学分析，探讨其致病原因。方法收集胎儿羊水细胞，联合使用羊水细胞染色体G显带核型分析、荧光原位杂交、荧光定量聚合酶链反应、染色体微阵列分析技术，并对其进行产前诊断。结果胎儿羊水染色体核型为45,X[34]/46,X,r(X)(::p21.1→q21.1::q26.2::)[16],CMA结果为arr[hg19] Xp22.33p21.1(168,551-36,345,937)x1,Xp21.1q21.1(36,345,938-82,025,634)x1～2,Xq21.1q26.2(82,025,635-130,609,928)x1,Xq26.2(130,610,054-130,821,538)x1～2,Xq26.2q28(130,989,602-155,233,098)x1。结论多种技术联合应用更精准地诊断环状X染色体的胎儿，明确了胎儿疾病的严重程度，为孕妇遗传咨询提供可靠的依据。

关键词：
产前诊断
染色体微阵列分析
染色体核型分析
环状染色体
荧光原位杂交
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特纳综合征（Turer’s syndrome,TS）又称卵巢发育不全综合征，是指由于一条X染色体缺失或结构发生异常而导致的一种染色体病，在新生女婴中发病率约为1/2500，其最常见的临床表现包括性腺发育异常、身材矮小、智力低下等[1]。环状X染色体是TS中较为罕见的类型，主要是X染色体的短臂和长臂两端同时发生异常断裂，然后断裂两端发生重接，形成环状染色体，在TS中发生率为5%[2]。为了提高对该疾病的认识，现将青岛大学附属妇女儿童医院基因检测中心联合应用羊水染色体G显带核型分析、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、荧光定量聚合酶链反应（quantitative fluorescence polymerase chain reaction,QF-PCR）、染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis,CMA）多种技术对一名嵌合型环状X染色体的胎儿进行细胞分子遗传学诊断，结果分析报告如下。

1、对象与方法

1.1对象

孕妇，27岁，孕20周，因孕妇无创产前检查（non-invasive prenztal testing,NIPT）结果提示胎儿性染色体数目偏少（见图1）为主诉就诊于青岛大学附属妇女儿童医院遗传咨询门诊。孕妇平素月经规律，非近亲结婚，孕期无化学物质、农药、放射性物质等接触史。孕妇血清学筛查为低风险，孕19周I级B超未见异常。经家属知情同意后，对孕妇行羊膜腔穿刺术，送检羊水进行羊水细胞染色体G显带核型分析、FISH、QF-PCR及CMA检测。同时对孕妇及丈夫行外周血染色体G显带核型分析。

所有项目均签署知情同意书，本研究经青岛大学附属妇女儿童医院伦理委员会审查批准，批号QFELL-YJ-2023-84。

图1孕妇无创产前检查X染色体图

1.2方法

1.2.1羊水染色体G显带核型分析

在严格无菌操作下经超声引导行羊膜腔穿刺术，取羊水20 mL，分两线（每管10 mL）进行完全独立的培养收获，置于37℃，5%CO2培养箱中半开放培养7 d，换液、收获、制片、消化、染色，每线核型计数15个中期分裂相，如遇嵌合型增加计数至25个，分析3个核型，参照人类细胞基因组学国际命名机制（ISCN2020）进行染色体核型描述。

1.2.2荧光原位杂交检测

采用北京金菩嘉医疗科技有限公司CSP18/X/Y探针，CSP18:18p11.1-q11.1（蓝色信号）/CSPX:Xp11.1-q11.1（绿色信号）/CSPY:Yp11.1-q11.1（红色信号），判读标准：干净背景下，杂交信号清晰处，计数100个细胞或50个中期核型，判断异常染色体数目的比例。

1.2.3荧光定量聚合酶链反应

采用广州达安基因股份有限公司性染色体多倍体检测试剂盒，扩增6个特异性单核苷酸多态性位点（DXS1187、DXS8377、DXS6809、DXS981、AMXY、SRY），美国ABI公司3130基因分析仪进行片段分析；GenMapper 4.0软件系统进行定量分析。通过分析位点基因峰的数量和等位基因峰面积比值，其中：双峰峰面积比值为0.9～1.1为正常二体；连续2个单峰提示可能杂合性缺失；双峰比值<0.9或>1.1提示存在嵌合体。

1.2.4染色体微阵列检测

采用全基因组CytoScan750K芯片（美国Affymetrix公司），严格按照标准操作流程进行。实验步骤主要包括DNA提取、酶切、连接、PCR、PCR产物纯化、片段化、标记、杂交等步骤。应用Affymetrix Chromosome Analysis Suite(ChAS 3.0）进行分析，结果判读参考DGV、DECIPHER、UCSC、ISCA、PubMed、OMIM和ClinGen等数据库以及相关文献报道。

2、结果

2.1染色体G显带核型分析

胎儿羊水染色体核型为45,X[34]/46,X,r(X)(::p21.1→q21.1::q26.2::)[16]，见图2；孕妇及丈夫外周血染色体核型正常。

2.2荧光原位杂交检测

CSP18/X/Y探针杂交后，在间期细胞中可见1个或2个X染色体（绿色信号），2个18号染色体（蓝色信号），未发现Y染色体（红色信号），计数100个间期细胞结果为：nuc ish (CSPX×1)[45/100]/(CSPX×2)[55/100]，在中期分裂相中异常的环状X染色体可见1个绿色信号（图3黄色箭头），正常的X染色体可见1个绿色信号（图3红色箭头）。

2.3荧光定量聚合酶链反应

结果显示在Xq26.2、Xq28、Xq21.33这三处位点均为单峰，Xq13.1位点处比值为1∶0.8杂合双峰，提示胎儿的X染色体存在大片段的杂合性缺失，并有嵌合可能，见图4。

2.4染色体微阵列分析

胎儿羊水细胞CMA分析结果arr[hg19]Xp22.33p21.1(168,551-36,345,937)x1,Xp21.1q21.1(36,345,938-82,025,634)x1～2,Xq21.1q26.2(82,025,635-130,609,928)x1,Xq26.2(130,610,054-130,821,538)x1～2,Xq26.2q28(130,989,602-155,233,098)x1，见图5和表1。

2.5妊娠结局

经上述方法诊断此胎儿为嵌合型环状X染色体TS患儿，由父母染色体验证，胎儿为新发变异，经遗传咨询，家属知情同意后，孕妇于孕23周终止妊娠，在外院引产，并拒绝对胎儿做进一步相关检测。

图2胎儿羊水染色体G显带核型分析

图3染色体中期核型X探针信号图

3、讨论

TS是成活女性中最常见的一种性染色体异常，典型的临床表现身材矮小，第二性征发育不全，卵巢和子宫发育不良，原发性闭经，颈蹼，后发际线低，肘外翻，智力通常与一般人群相当，但有部分TS患者较正常同龄人平均智力低下[3]。TS主要是一条X染色体的丢失或结构发生改变导致的异常，其中环状X染色体较为罕见，Pristyazhnyuk等[4]对环状染色体形成的机制进行总结，主要有3种：染色体的长短臂两端同时断裂，断裂末端融合形成环状染色体，无着丝粒的两端相接，因其无着丝粒在细胞分裂时就会丢失，从而导致染色体的部分单体，有遗传物质的丢失；端粒或亚端粒区融合形成环状染色体，无显著的遗传物质的丢失，患者往往无明显表型异常；但可能会有生殖生育等问题；染色体复杂的倒位、缺失、重复变异所形成的环状染色体。

矮小同源盒基因（short stature homeobox containinggene,SHOX）为生长控制基因，参与骨骼发育，位于Xp22区域，其发生突变、缺失引起单倍剂量不足时，可导致身材矮小、骨骼发育异常[5]，所以身材矮小是TS最恒定的特征。X染色体长臂上的Xq26-Xq28和Xq13-Xq22是决定性腺功能关键区，为卵巢早衰I区和卵巢早衰II区，这两个关键区域中含有特定的卵巢决定基因，是决定卵巢发育及功能的基因，与原发性闭经、卵巢早衰有关[6,7]。本病例中Xp22和Xq26-Xq28区段都是单倍剂量不足区段，该类患者可有身材矮小、生殖功能异常（不孕、卵巢早衰）等临床表现。

本文研究对象缺失部位中还包括IL1RAPL1基因，缺失会导致X连锁精神发育迟滞。NR0B1基因的缺失会导致X连锁先天性肾上腺发育不良（AHC)[8]。PCDH19基因其致病性变异可导致伴X染色体遗传的早发性癫痫脑病9型（DEE9)[9]。DEE9起病于婴儿期，癫痫以丛集性发作为特点，癫痫患儿的发作频率可随年龄的增长而减少甚至不再发作。STAG2基因（OMIM:300826）其致病性变异可导致前脑无裂畸形13型及Mullegama-KleinMartinez综合征。前脑无裂畸形13型为一种神经系统疾病，其特征是胚胎中线发育缺陷，主要影响胎儿大脑和颅面结构。Mullegama-Klein-Martinez综合征临床表现主要为：整体发育迟缓、小头畸形、脊柱侧弯、胼胝体压部发育不全，唇腭裂、第五指斜指畸形、足部多指畸形等。在谢清华[10]报道中病例2因超声提示“胎儿胼胝体发育不良（完全型）”就诊，羊水染色体核型为46,X,r(X)(p11.1;q13.3)[35]/45,X[15]，本报告提供的环状X染色体嵌合型TS胎儿表型的文献复习，增加了对TS胎儿的产前遗传咨询理论。结合以上部位缺失本病例胎儿还可能有以下临床表现：并指畸形，异常面容（五官粗糙、眼距宽、宽鼻、鼻翼前倾、宽嘴薄上唇、眼裂长），淋巴水肿等，此外部分患者还存在智力异常及行为异常（攻击性、冲动性、自闭症样表现、沟通能力受限和强迫行为）等。

图4胎儿X染色体的QF-PCR结果

图5胎儿CMA异常X染色体示图

表1胎儿CMA分析结果

嵌合型环状X染色体TS患者的临床表现与经典型的TS患者有一定的区别：部分环状X染色体TS患者可以生育，这与环状X染色体缺失片段的大小、缺失基因、嵌合的比例有关。在宋银森[11]报道中回顾36例环状X染色体的病例中，有4例有正常的青春期发育，3例能生育。Dallapiccola等[12]报道1例环状X染色体患者，其X断点为Xp13及Xq27，她生育了一与其同样核型的女儿。X染色体的Xq13→q28区域对性腺发育起关键作用，女性两条X染色体上Xq13→q28的完整性对性腺功能是很重要的；环状X染色体TS的智力低下的临床表现较经典型TS要严重。原因可能是环状X染色体未失活，致使部分基因高表达造成严重表型[13]。环状X染色体是否出现智力障碍很大程度上取决于环中有无XIST基因。XIST基因位于Xq13.2，编码一段15～17 kb长的lncRNA，其作用为：包被在其所在的X染色体上，起到启动X失活和维持X失活的作用。XIST缺失型患者有严重临床表型，而XIST基因未缺失的患者表型则取决于环状X染色体的大小和嵌合比例，其表型可与TS患者类似，也可接近正常人。但是某些病例中即使有XIST基因，也有一部分患者出现以智力障碍为主的各种异常。原因可能为：环状X染色体环的长度影响X染色体失活，环越长越难失活[14]导致部分基因高表达；胚胎时期选择失活了正常的X染色体，环状X染色体的基因缺失导致缺失效应[15]。

本研究中，胎儿羊水染色体核型为嵌合型的环状X染色体，其父母的外周血染色体核型均为正常，由此我们可以判断胎儿为新发变异。在快速试验中FISH和QF-PCR都提示胎儿的X染色体存在杂合缺失和嵌合的可能性，常规的染色体G显带核型分析结果初步判断为胎儿为嵌合的环状X染色体，但分辨率较低，无法判断X染色体的断裂点，通过CMA检测结果我们可推断断裂重接点在X染色体的p21.1和q21.1处，再通过中期分裂相的FISH验证异常染色体确为环状X染色体，验证核型分析结果。在本研究中我们采用了多种诊断技术相联合以明确环状结构的来源、缺失区域及关键基因。由此可见对于多种检测方法在遗传学产前诊断中的联合应用是至关重要的，可提供更精准的产前诊断，根据细胞分子遗传学结果给孕妇做出针对性的遗传咨询，丰富了染色体异常胎儿产前遗传咨询的理论，提供了可靠的遗传咨询依据。

参考文献:

[2]邬玲仟,张学医学遗传学[M].北京人民卫生出版社, 2016:24-25.

[7]何轶群郭莉郑来萍,等应用荧光原位杂交技术诊断嵌合型环状X染色体Turner综合征1例[J]中国产前诊断杂志(电子版), 2021, 13(3)-53-56.

[10]谢清华应用多种技术综合诊断胎儿嵌合型X环状染色体[J]中国优生与遗传杂志,2018, 26(2):46-48.

[11]宋银森. Turner综合征患者X环状染色体细胞遗传学效应分析[J].中国优生与遗传杂志,2012, 20(1):41-46.

[13]陈黎恒陶逸伦,胡志鹏,等.一例环状X染色体产前诊断和遗传咨询策略研究[J].中华医学遗传学杂志, 2022, 39(6):658-66 1.

[14]吴轲,朱沅珍,王璐.1例环状X染色体嵌合型Turner综合征的产前诊断与遗传咨询[J]中国产前诊断杂志(电子版), 2022, 14(4):52-56.

[15]王亚男,赵伊萌,秦丹丹.1例嵌合型环状X染色体Turner综合征患者的细胞遗传学分析[J]中国优生与遗传杂志,2022.30(3):498-499.

基金资助:青岛市临床重点专科建设项目;

文章来源:任慧颖,王芳,韩美艳等.多种技术在1例嵌合型环状X染色体胎儿产前诊断中的联合应用[J].中国优生与遗传杂志,2023,31(10):2121-2126.