宫颈病变是妇科疾病中的一组常见疾病群，包括人乳头瘤病毒(HPV)亚临床感染、宫颈癌及宫颈癌前病变；宫颈癌是对女性危害极大的疾病之一[1]。宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位；宫颈癌全球每年新发病例约为50万，占所有癌症新发病例的5%,其中80%以上的病例在发展中国家[2];中国每年新发宫颈癌病例达13.15万，宫颈癌死亡人数每年约5.3万，约占全部女性恶性肿瘤死亡人数的18.4%,发病率呈上升趋势[3]。宫颈癌的癌前病变是宫颈上皮内瘤变(CIN),分为CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级，CINⅠ级大部分有可逆性，可随访，CINⅡ/Ⅲ级是需要治疗的。而目前的分级依据只反映不同位置上细胞和上皮之间数量上的变化，而非性质上的差异；因此，易存在诊断不当，造成治疗不足或过度治疗。因此，寻找一种特异度和灵敏度高的检测方法对CINⅡ/Ⅲ级的诊断具有积极意义。增殖细胞核抗原(PCNA)是由Miyachi等[4]于1978年首次发现并提出的，又称为周期蛋白，与细胞增殖周期相关，可作为监测细胞增殖的可靠生物学标志物。微血管密度(MVD)可对肿瘤血管进行定量研究，是目前评估肿瘤血管生成状态的最佳指标[5]。宫颈病变的发生、发展与细胞增殖的调控、血管生成具有密切关系。本研究探索宫颈病变中的PCNA与MVD表达的相关性，旨在为CIN,特别是CINⅡ/Ⅲ级的诊断提供参考依据。

1、资料与方法

1.1资料来源

选取2018年12月—2020年12月杭州市第三人民医院因宫颈癌筛查异常行阴道镜下宫颈活检并经病理证实的CIN后行宫颈环形电切除术或宫颈冷刀锥切手术的石蜡标本63例(包括CINⅠ级28例及CINⅡ/Ⅲ级35例)为观察组，另选取同期在本院因子宫肌瘤行子宫切除术病理诊断为正常宫颈组织25例为对照组。对照组患者年龄35～65岁，平均(50.80±5.67)岁；CINⅠ级组患者年龄30～65岁，平均(50.30±5.41)岁；CINⅡ/Ⅲ级组患者年龄26～68岁，平均(49.60±5.20)岁。3组患者年龄比较，差异无统计学意义(t=2.439,P>0.05),具有可比性。所有病例术前均未接受过任何治疗(包括手术、激光、光动力、射频、微波、放疗、化疗及免疫治疗等),临床和病理资料完整。本研究经医院医学伦理委员会审批通过(伦理号：KL2019072),所有患者均对本次研究知情并签署同意书。

1.2方法

1.2.1仪器和试剂

水浴锅(SHA-C,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);图像采集(采用QLUIMPUSBX41荧光湿微镜和NIKON DIGITAL SIGHT彩色CCD);数据分析软件：image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司)。免疫组化SP通用染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；鼠抗人PCNA单克隆抗体工作液购自福州迈新生物技术开发公司；CD34鼠抗人单克隆抗体工作液和DAB显色试剂盒购自荷兰英特奈尔生物技术公司。

1.2.2研究方法

严格按照免疫组化SP法试剂盒说明进行操作，以磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照。具体方法：将选取的标本蜡块按4μm厚度进行切片，每例5张切片；石蜡切片脱蜡[二甲苯浸泡5 min、二甲苯浸泡5 min、无水酒精浸泡1 min、95%酒精浸泡1 min;切片脱水后，在蒸馏水中漂洗5 min;高压修复：切片放入抗原修复盒，高压修复(修复液为pH值8.0的EDTA或pH值6.0的枸橼酸缓冲液)高压锅上气后10 min,取出抗原修复盒，自然晾至室温；取出切片放入蒸馏水冲洗2次，每次5 min;擦干切片，再滴加1滴3%的过氧化氢溶液(以阻断内源性过氧化物酶的活性),37℃恒温箱中温育15 min;放入蒸馏水中洗涤2次，每次5 min;切片擦干后，滴加pH值7.8的胃蛋白酶，37℃恒温箱中温育30 min;蒸馏水冲洗5 min, PBS(pH值7.4)冲洗5 min;滴加封闭液，37℃恒温箱中温育15 min,不擦干周围液体(注意不要干片);擦干切片，滴加适当浓度的(PCNA稀释度为1∶50; CD34稀释度为1∶500)一抗，4℃过夜；蒸馏水冲洗，PBS(pH值7.4)冲洗5 min;擦干切片后，滴加二抗工作液，37℃恒温箱中温育40 min;蒸馏水冲洗2次，每次5 min;每张切片加2滴新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察10～30 min镜下监测显色过程，适时终止反应；自来水冲洗，苏木紫染色2 min,分化液30 s,返蓝30 s;酒精、二甲苯依次脱水(95%酒精1 min、无水酒精1 min、二甲苯1 min、二甲苯1 min)];中性树胶封片，晾干。在光学显微镜下观察组织的染色情况。用PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.3结果判断

PCNA阳性判断标准是以细胞核出现棕黄色颗粒沉着为阳性细胞，定位在细胞核，通过观察细胞核染色阳性细胞计分。PCNA免疫组化采用半定量评分标准：每张切片任选5个观察视野。采用染色强度和染色细胞百分率综合计分。按染色强度计分：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。计算阳性细胞百分率(5个视野的平均数):阳性细胞<10%为0分，阳性细胞11%～25%为1分，阳性细胞26%～50%为2分，阳性细胞51%～75%为3分，>75%为4分，两者乘积所得分数×0.5为阳性指数，按阳性指数分值对表达程度进行评分：≤1分为阴性；>1分为阳性；≥3分为阳性过表达。MVD结果判定：按Weidner法测定CD34蛋白标记病变组织血管内皮细胞显示血管，测定微血管密度，MVD计数单位：个数/高倍视野(个数/HP)。血管内皮细胞出现棕黄色颗粒判定为CD34阳性。在光学显微镜低倍视野下(×40)评价整个组织切片，在病变区域选取EC染色清晰、背景对比良好、微血管数量最密集的视野；在上述选定视野范围内以400倍视野分别计数3个视野中染成棕黄色的微血管数，取其平均值，并以此作为MVD。由指定的病理医师在不知病理结果的前提下计数MVD。

1.3统计学分析

所有数据运用SPSS 22.0版统计学软件进行分析处理，计量资料以(x¯±s)的形式表示，数据比较采用t检验；计数资料以百分率(%)的形式表示，数据比较采用χ2检验或Fisher检验；相关性分析采用Pearson相关性分析法，诊断效能采用受试者工作特征(ROC)曲线进行评价，并应用Youden指数寻找最佳截点，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 PCNA和MVD在对照组、CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ级组中的表达情况

对照组、CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ级组PCNA的阳性表达情况见图1,随着宫颈病变程度加重表达率逐渐增加。MVD在对照组、CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ级组的表达情况见图2,随着宫颈病变程度加重MVD的数量逐渐增多，但在CINⅡ/Ⅲ级增多明显。

图1 PCNA在对照组、CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ组中的表达(免疫组化SP,×100) 

图2 MVD在对照组、CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ组中的表达(免疫组化SP,×40)  

2.2 PCNA和MVD在对照组、CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ级组中的阳性表达率和表达水平比较

CINⅠ级组与CINⅡ/Ⅲ级组PCNA阳性表达率均明显高于对照组，差异均有统计学意义(χ2=18.15、23.60,均P<0.05);但CINⅠ级组与CINⅡ/Ⅲ级组PCNA阳性表达率比较，差异无统计学意义(χ2=0.01,P>0.05)。CINⅡ/Ⅲ级组PCNA阳性过表达率明显高于CINⅠ级组和对照组，差异均有统计学意义(χ2=22.97、45.04,均P<0.05)。CINⅠ级组与CINⅡ/Ⅲ级组MVD表达均明显高于对照组，差异均有统计学意义(t=5.883、12.727,均P<0.05);CINⅡ/Ⅲ级组明显高于CINⅠ级组，差异有统计学意义(t=5.645,P<0.05)。3组患者宫颈组织中PCNA和MVD阳性表达情况比较见表1。

表1 3组患者宫颈组织中PCNA和MVD阳性表达情况比较

2.3宫颈组织中PCNA与MVD的相关性

Pearson相关性分析显示，PCNA与MVD存在呈正相关关系(r=0.595,P<0.05)。

2.4宫颈组织中PCNA和MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的ROC曲线

ROC曲线显示，应用PCNA和MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的价值明显高于PCNA和MVD单独诊断CINⅡ/Ⅲ级的价值，差异均具有统计学意义(Z=2.29、2.02,均P<0.05);Youden指数提示PCNA和MVD诊断CINⅡ/Ⅲ级的最佳截点(cut-off值)分别为≥2.94和≥21.50。PCNA和MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的ROC曲线见图3,宫颈组织PCNA和MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的价值见表2。

图3 PCNA和MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的ROC曲线  

表2宫颈组织PCNA和MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的价值

3、讨 论

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，发病呈年轻化趋势，严重影响女性健康[6]。CIN是与子宫颈浸润癌密切相关的子宫颈病变，约有15%发展为子宫颈癌；大部分的CINⅠ级可自然消退，治疗上可随访观察，随访过程中如出现病变发展或持续存在2年再进行治疗；但CINⅡ/Ⅲ级具有癌变潜能，可发展为浸润癌，均需要治疗[7];故对CINⅡ/Ⅲ级的诊断尤为重要。目前病理诊断的分级依据只反映不同位置上细胞和上皮之间数量上的变化，而非性质上的差异，有时难以区分，造成治疗不足或过度治疗[3]。目前，在国内开展的有关宫颈病变组织的检测项目较多；但联合检测PCNA和MVD的研究较少。本研究检测宫颈病变组织中的PCNA和MVD的阳性表达情况，旨在探索宫颈病变中的PCNA和MVD的阳性表达与宫颈病变严重程度的相关性，从而提高CINⅡ/Ⅲ级诊断率，为治疗提供重要参考依据。

本研究结果显示，对照组PCNA的阳性表达率为64.00%;CINⅠ级组PCNA的阳性表达率为96.43%;CINⅡ/Ⅲ级组中PCNA的阳性表达率为100.00%;CINⅠ级组、CINⅡ/Ⅲ级组PCNA阳性表达率明显高于对照组；CINⅠ级组与CINⅡ/Ⅲ级组PCNA阳性表达率无显著性差异；但在PCNA阳性过表达率方面，对照组PCNA阳性过表达率为4.00%,CINⅠ级组PCNA阳性过表达率为32.14%,CINⅡ/Ⅲ级组PCNA阳性过表达率为91.43%;CINⅡ/Ⅲ级组明显高于CINⅠ级组和对照组。CINⅠ级组与CINⅡ/Ⅲ级组MVD均明显高于对照组；CINⅡ/Ⅲ级组明显高于CINⅠ级组，CINⅠ级组、CINⅡ/Ⅲ级组MVD明显高于对照组；CINⅡ/Ⅲ级组MVD明显高于CINⅠ级组。

PCNA分子量大小为36kDa,主要分布在细胞核中，实质上是一种酸性非组蛋白核蛋白，其存在于增殖性细胞(包括正常增殖细胞和异常增殖细胞)。研究[8]发现PCNA与细胞DNA合成具有紧密关系，是DNA合成过程中必不可少的物质，特别是在细胞增殖的启动上具有重要作用，直接参与细胞的增殖和DNA的合成过程；PCNA还参与许多细胞重要生理事件，如细胞DNA损伤修复、细胞周期调控、染色体重组、DNA甲基化及细胞凋亡等，在不同通路的调控中，PCNA可作为多种蛋白的功能转换因子起作用。PCNA为DNA聚合酶的一种辅酶，参与细胞异常增殖过程中DNA复制和细胞周期调控，其表达程度和含量能够准确反映细胞的增殖状态和生长速度情况；已被广泛应用于细胞异常增生的实验研究[9]。研究[10,11]表明，PCNA含量在细胞复制过程中呈现出周期性的变化，其含量在细胞有丝分裂S期达到峰值，这种周期性变化与细胞有丝分裂过程中DNA含量的变化情况具有一致性，表明PCNA的表达程度与细胞的分裂增殖速度存在密切关系。在常见的食道癌、甲状腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌等疾病中均有PCNA的异常表达。周淑君等[12]研究结果发现，CINⅠ期组、CINⅡ期组、CINⅢ期组及早期宫颈癌组中的PCNA阳性表达均高于慢性宫颈炎组。赵义等[13]研究结果发现，宫颈癌组、CINⅡ/Ⅲ组PCNA阳性率高于CINⅠ组；宫颈癌组、CIN组Ki-67表达阳性率明显高于宫颈炎组，且宫颈癌组、CINⅡ/Ⅲ组Ki-67阳性率高于CINI组；宫颈癌组与CIN组中PCNA、Ki-67过表达情况明显高于宫颈炎组，且CINⅡ/Ⅲ组PCNA、Ki-67过表达率明显高于CINⅠ级组；PCNA表达强度与HPV感染呈正相关关系；Ki-67表达强度与HPV感染呈正相关关系。本研究结果显示，在正常上皮组织中，PCNA阳性表达率为64.0%,其阳性表达大部分在具有增殖、分化能力的基底细胞层及其附近细胞；而在CIN患者组织中，PCNA阳性表达率较高，这与国内的一些研究[14,15]结果一致；其原因可能是HPV可以活化PCNA基因，HPV某些基因产物刺激PCNA在宿主细胞中出现过度表达。

MVD可以定量反映组织中血管的生成情况，其是可以评价血管生成的指标，MVD值越高，表明新生毛细血管的生成越丰富[16]。MVD计数可以作为定量分析肿瘤血管生成情况的指标，可以反映肿瘤的浸润和转移能力。目前常用免疫组织化学的方法标记血管内皮细胞上的特异性分子。目前最常用的是CD34、CD105及Ⅷ因子相关抗原，其中CD34、CD105均为血管内皮的特异性糖蛋白。有研究[17]发现，CD34在大小血管中均有表达，CD105表达于较小的血管。本文选用CD34作为标记分子，采用免疫组化方法检测MVD。陈燕飞等[18]研究结果发现，低级别宫颈鳞状上皮内病变、高级别宫颈鳞状上皮内病变宫颈组织中MVD和VEGF表达明显高于非宫颈鳞状上皮内病变，MVD和VEGF的表达随宫颈病变的加重而升高；进一步检测CDFI血流参数显示，非宫颈鳞状上皮内病变组和低级别宫颈鳞状上皮内病变组的RI均明显低于高级别宫颈鳞状上皮内病变组，PSV明显高于高级别宫颈鳞状上皮内病变组，但非宫颈鳞状上皮内病变组与低级别宫颈鳞状上皮内病变组间无差异。薛宏等[19]研究结果发现，宫颈癌组织中CDK8、VEGF及p53蛋白表达水平升高，促进肿瘤细胞的生长和转移，CDK8、VEGF可能与肿瘤血管生成有关。本研究结果显示，MVD随宫颈病变严重程度的增加而升高，表明微血管生成在宫颈病变过程中发挥重要作用，与国内相关研究[20]结果一致。

采用Pearson相关性分析提示，PCNA与MVD呈正相关关系。分析认为增殖是细胞重要的生物学行为之一，细胞周期失控和异常增殖导致癌前病变，甚至肿瘤的发生。血管是癌前病变和肿瘤形成的重要因素，MVD是评估肿瘤血管生成状态的常用指标；CD34是一种黏附分子，主要在血管内皮细胞表达，在细胞间黏附过程中发挥重要作用，是MVD常用的标记蛋白，其高表达是微血管密度增多，组织需要氧气和血液的体现，MVD的增多为病变细胞的增殖和生长生提供营养和氧气。因此，随着宫颈病变严重程度的增加，宫颈组织中PCNA和MVD也随之呈现高表达。

ROC曲线提示，PCNA与MVD联合诊断CINⅡ/Ⅲ级的价值明显高于二者单独诊断；Youden指数提示PCNA与MVD诊断CINⅡ/Ⅲ的最佳截点分别为≥2.94和≥21.50。究其原因，可能原因为每项指标单独检测时难免会受到诸多因素干扰，出现不可避免的误差，导致检出率下降，出现漏诊。联合检测时，二者间具有协同作用，能有效弥补单项指标检测中的不足，提高诊断准确性度。

综上所述，CIN患者的宫颈组织中的PCNA与MVD呈正相关关系，联合检测能协助鉴别宫颈不同程度的病理改变和严重程度，特别可提高CINⅡ/Ⅲ级诊断率，可避免临床治疗不足或过度治疗。

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基金资助:浙江省杭州市科技发展计划项目(20191203B112);

文章来源:陈燕,袁马驰,赵霞.宫颈组织中增殖细胞抗原和微血管密度的表达及相关性分析[J].中国妇幼保健,2023,38(21):4241-4246.