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三种染色体检测技术在出生缺陷防控中的应用价值分析

2024-05-29 89 上传者：管理员

摘要：目的：探讨细胞核型分析、快速染色体异常检测以及染色体微阵列分析(CMA)技术在出生缺陷防控中的应用价值，综合评价各种技术的应用范围。方法：收集在我院行产前诊断染色体检查的标本362例，按检测方式分别统计，其中第一组统计细胞学遗传分析，第二组统计定量荧光多聚酶链反应技术(QF-PCR),第三组统计CMA,统计对比三组检测结果，研究和了解三种检测方法各自的优势和局限性，得出结论。结果：第一组362例标本，细胞核型分析检测结果时间14～30d,平均(22.17±1.15)d,总检出率6.35%(23/362);第二组362例标本，QF-PCR检测结果时间2～6d,平均(2.01±1.89)d,总检出率4.70%(17/362);第三组280例标本，CMA检测结果时间7～27d,平均(16.73±1.80)d,总检出率12.14%(34/280)。三组总检出率相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：随着孕妇年龄增加，染色体异常率呈现上升趋势，现阶段适用的产前诊断方案还是应以细胞遗传学技术为基础，联合QF-PCR提高唐筛高风险或高龄孕妇标本的检测速度，而CMA可用于胎儿发育异常但前两种检测技术正常者的有效补充，能有效降低胎儿出生缺陷的发生，因此在实际应用过程中应根据临床指标选择相应技术进行检测。

关键词：
CMA技术
QF-PCR
快速染色体异常检测
染色体检测
细胞核型分析
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出生缺陷是指婴儿在出生前所发生的结构、功能或者代谢异常等，导致出生缺陷的常见原因之一为染色体异常。当前，随着社会的发展和人民的生活质量的提升，人们对自己的健康的认识在持续增强，因此，如何保证后代的健康受到更多人的重视[1,2]。常规的染色体核型分析可发现染色体数量和结构的异常，是目前临床上最常用的一种产前检查手段，但其具有很大的局限性。染色体微阵列分析(CMA)作为一项新兴的全基因组测序技术，与染色体核型相比，该技术可以更准确地探测到一些染色体上的复制变化，特别是对一些小的丢失或复制现象。应用荧光定量PCR(Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction, QF-PCR) 技术对唐氏综合征进行了早期筛查。该方法具有快速、准确、成本低、灵敏度高、特异性强等优点[3],目前已经在许多国家的产前诊断中心得到了推广。但在此基础上，结合两项技术进行产前诊断的临床应用尚不多见，很难形成可靠的循证医学证据。本研究采用细胞学遗传分析、QF-PCR、CMA技术对标本进行染色体检测，分析三种染色体检测技术在出生缺陷防控中的应用，旨在提高临床效果，报告如下。

1、资料及方法

1.1 一般资料

随机选择2022年1月—2023年6月于我院行产前诊断染色体检查的孕妇，收集在我院行产前诊断染色体检查的标本共362例，其中280例三种技术均做检测，82例只做染色体核型分析和定量荧光多聚酶链反应技术。按检测方式分别统计，第一组统计细胞学遗传分析技术，第二组统计定量荧光多聚酶链反应技术，第三组染色体微阵列分析技术，用统计学方法统计三组检测结果，研究和了解三种检测方法各自的优势和局限性，得出结论。孕妇年龄15～47岁，平均年龄(32.2±2.84)岁，共362例。两组基本资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

在妊娠16～24周，在无菌的情况下，由临床医生在B超定位后，对羊膜腔进行穿刺，丢弃掉首先抽出的羊水大约2mL,之后再抽出20mL的羊水，放到两个无菌离心管中，若有QF-PCR和CMA标本则相应抽取多10～20mL羊水混匀后装入无菌离心管中常温即时送检，20mL标本常规羊水培养，另外QF-PCR和CMA标本则外送广州市妇女儿童医院。

染色体核型分析：实验方法及报告标准：将20mL羊水以1 200r/min离心10min, 弃上清，根据沉淀量加入4～5mL羊水培养基吹吸打混，放入37℃,5%CO2培养箱中进行培养，5～7d后进行观察，待细胞长成5～7个以上克隆后换液，换液2d后进行收获，滴片，显带。上机进行核型分析，每份标本至少分析5个核型，计数20个细胞，嵌合体相应增加细胞计数，根据《ISCN 2020》报告规则报告。

QF-PCR检测：实验方法：从样本中提取DNA,采用多重荧光PCR对DNA模板进行扩增，扩增后产物在ABI3130xl遗传分析仪上进行电泳分析。

CMA技术检测：(1)检测方法及内容：采用Affymetrix CytoScan 750K芯片检测全基因组拷贝数变异(CNV),同时还可检测杂合性缺失 (LOH)及单亲同源二体(iso-UPD),并可检测比例>30%的嵌合体。使用ChAS软件分析数据，参考基因组为 GRCh37(hg19)。CytoScan 750K 芯片共包含75万个探针(55万个寡核苷酸探针和20万个SNP探针)。(2)检测报告原则：缺失片段≥500Kb(Marker≥50),重复片段≥1Mb(Marker≥50);LOH:(常染色体)印记染色体片段≥5Mb, 非印记染色体片段≥10Mb; 原则上不报告良性和可能良性的CNV,对于报告阈值下限的临床意义不明确CNV将不报告；在报告阈值下限的变异，会根据其临床意义的相关性酌情报告。

1.3 观察指标

观察三组致病性异常检出率。

1.4 统计学方法

相关数据统计使用SPSS24.0软件分析数据，计数资料以率(%)表示，进行配对χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

第一组362例标本，核型分析检测结果时间14～30d, 平均(22.17±1.15)d, 总检出率6.35%(23/362),共检出23例致病性异常，1例培养失败，其中染色体数目异常19例：XXY 3例，XXX 2例，21三体9例，18三体2例，13三体1例，嵌合体2例，结构异常4例，另有22例多态性异常；第二组362例标本，QF-PCR检测结果时间2～6d, 平均(2.01±1.89)d, 总检出率4.70%(17/362),共检出17例致病性异常，其中XXY 3例，XXX 2例，21三体9例，18三体2例，13三体1例；第三组280例标本，CMA检测结果时间7～27d, 平均(16.73±1.80)d, 总检出率12.14%(34/280)。其中XXY 2例，XXX 2例，21三体7例，18三体2例，13三体1例，致病性微重复、微缺失CNV 4例，另有微重复7例和微缺失6例，微缺失合并微重复3例，1例嵌合重复，LOH 1例，均为临床意义不明确。三组总检出率相比，差异有统计学意义(χ2=13.245,P=0.001 33<0.05)。

3、讨论

我国是人口大国，是出生缺陷高发国家。目前我国出生缺陷发生率在5.6%左右，染色体异常是引发出生缺陷最常见的原因之一[4,5,6]。我市妇幼保健院作为市内唯一的产前诊断机构，肩负着本地区出生缺陷防控的重任。随着染色体检测技术的发展，越来越多的染色体微小变异被发现，传统细胞学遗传技术分析已不能满足目前的检测需要了。

从以上研究结果可以看出，检测21、18、13号染色体及性染色体的特异度及敏感性方面，三种方法在检测染色体异常方面并没太大差异，但从检测时间上QF-PCR能快速检测相关异常，因此在检测高龄及唐筛高风险上能快速得出结果，从而进行早期干预，减缓孕妇及其家属的焦虑。但检测其他染色体异常方面来看，QF-PCR显现出其局限性：检查仅对 21、18、13号染色体及性染色体进行检测，不能检测其他染色体；只能判断 21、18、13号染色体及性染色体的数目有无异常；不能排除有染色体的结构异常，也不能排除有一些小的染色体的异常或一些基因的变异[3]。而CMA在检测拷贝数变异(CNV)方面有其独特优势，能对整个基因组DNA拷贝数变异进行检测并精确定位到染色体上，清楚显示变异段基因含量，对于临床诊断不平衡染色体畸变方面有着突出优势。虽然CMA相比其他染色体异常分析技术具有很多优越性，但实验中也可看出，CMA在检测平衡性畸变方面存在缺陷；其次，正是由于CMA技术其分辨率高的特性，检测变得很敏感，能够检测出大量的良性及临床意义不明的拷贝数变异，孕妇及其家属产生了不应有的忧虑，并造成了一些没有必要的流产[7,8,9,10]。Van den Veyver等[11]研究发现CMA能够检测2.3%常规染色体核型分析未能发现的异常。研究表明正常人基因组存在着大量良性的CNV,因此，在CMA检测得出结果前，需要查阅大量数据库，判断该CNV是良性还是致病性。再次，CMA无法检测<30%的嵌合体，且检测价格昂贵。这些原因均影响CMA进一步推广。细胞遗传学技术在现阶段仍是产前诊断最关键也是最基本的技术，具有无可取代的地位，是每一个产前诊断中心都必须具备的技术。目前国内大部分实验室采用的是细胞双线培养，即同时使用两种培养基和不同的培养箱进行培养，且在换液时须保留备份，以防发生意外，提高培养的成功率和诊断准确性。从实验结果看出，细胞遗传学技术在平均报告时间是最长的，容易导致孕妇及其家属的焦虑心情，其原因在于细胞培养耗时长、操作烦琐。虽然核型分析与其他两种染色体技术在检测21、18、13号染色体及性染色体数目异常方面相差不大，但对于染色体平衡性易位及倒位检测仍有无可代替的作用，但是，如果是易位或者倒位的话，那么在怀孕的时候，就会出现流产、不育以及基因重排的情况[6,12]。且在检测嵌合体方面并没有限制，只要严格按照报告标准报告即可。

在产前检查中，细胞基因检测是十分关键的环节，13、18、21号染色体及性染色体的非整倍性，是孕期检查常见的染色体异常。在遗传因素中，染色体异常最常见，染色体非整倍体异常是最常见的染色体畸变类型，严重危害着人类健康。对于这种病症，现在还没有很好的疗法，造成了巨大的心理及经济压力，也造成了社会及家庭的巨大压力。所以，对胎儿进行染色体病变的早期检测具有非常重要的意义。

染色体核型分析是产前检查最常见的一种检查方式，可以从羊膜腔穿刺、绒毛膜活检、脐静脉血穿刺等获得胚胎细胞。通过对不同类型的胚胎进行核型分析，发现不同类型的胚胎有不同程度的异倍性及不同类型的胚胎有不同程度的重排。而核型检测只是一个中间阶段，要进行细胞培养，通常要10～21d后，才能得到一个准确的数据。由于该方法存在周期长、检测时间短、检测周期短、检测难度大、操作难度大等问题，制约了该方法的广泛应用。伴随着分子诊断技术的成熟与出现，逐渐有了FISH、MLPA、QF-PCR等细胞和分子遗传技术，它们操作十分便捷，短短24～48h就能知晓检验结果，羊水细胞培养中所存在的问题可以顺利解决。实施早诊早治，可减少孕妇和家庭的焦急等候；如果出现了畸形，应尽早进行引产，以降低因妊娠过大而导致的并发症。QF-PCR 是利用多个高杂合性 STR位点(通常选择>0.70的 STR)对胚胎染色体进行多个高杂合性 STR位点联合筛查。QF-PCR只需0.5～5mL的羊水，通常只有1～2mL,相对于其他的方法，它的样本容量是非常小的。该方法具有24h出结果、费用低廉、方法简便、可重复使用等优点。分子遗传学技术具有通量高、速度快(可以在数小时内完成检测并出具报告)等特点，此外， CMA技术是一种新型的检测方法，它在产前诊断中，尤其是在超声检查指征出现异常的时候，得到了越来越多的使用。它可以对全基因组 DNA的拷贝数变化，包括单亲二倍体、三倍体以及30%超过的嵌合体等，还可以对胚胎的全基因组进行扫描，从而达到对整个染色组的整体分析。本文采用传统的细胞遗传学方法、QF-PCR以及CMA技术，三种常用染色体检测技术的临床应用研究，综合评价各种技术的应用范围，为我市医疗机构了解和开展产前诊断检测技术提供一个参考，更好的指引临床医生明确细胞学遗传技术分析和分子生物学技术分析对染色体异常的检出和适用状况，要对孕妇进行适当的产前检测，并以检测结果为依据，采用有针对性的对策，来提升染色体病的检出率，降低缺陷事件，提升新生儿的康复后和生命质量，能够大大缓解家庭与社会的压力[9]。

总之，随着孕妇年龄增加，染色体异常率呈现上升趋势，现阶段适用的产前诊断方案还是应以细胞遗传学技术为基础，联合QF-PCR提高唐筛高风险或高龄孕妇标本的检测速度，而CMA可以用于胎儿发育异常但前两种检测技术正常者的有效补充，能有效降低胎儿出生缺陷的发生，因此在实际应用过程中应根据临床指标选择相应技术进行检测。

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基金资助:云浮市医学科学技术研究立项(2022B036);