皮肤是人体最大的器官，其中表皮层位于皮肤最外层，不仅担负着机体屏障功能、吸收功能和感觉功能，也直接反映了个体皮肤的健康及代谢状况。角质形成细胞是表皮的主要细胞类型，其形态、大小和排列从基底层到角质层随着细胞分化与更新而发生有规律的变化，具有表皮构成、创伤修复、细胞角化、细胞因子分泌和免疫监视等功能[1,2]。角质形成细胞的增殖活力下降、迁移不足、角化功能衰退会导致表皮萎缩变薄、皮肤干燥、皱纹产生和皮肤免疫功能退化，严重影响皮肤健康[3]。

间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脐带、胎盘和脂肪等组织中。MSCs除了能够支持造血、防治移植物抗宿主病，还能修复骨和软骨、肌腱、心肌、皮肤等组织损伤，被认为是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。多项研究表明，MSCs能够向皮肤创伤部位迁移、调节细胞炎症水平、诱导细胞外基质蛋白的合成与分泌，进而修复皮肤缺损和促进创面愈合[4,5,6]，此外还能促进异体移植皮肤存活[7]，改善纤维化[8]、减轻皮肤放射性损伤[9]。然而，目前关于MSCs对人表皮的潜在调节作用还鲜有报道。HaCaT由人皮肤永生化角质形成，拥有正常人表皮角质形成细胞的增殖、分化特性。本文以HaCaT细胞为模型，探究了人脐带间充质干细胞对HaCaT增殖和迁移的影响及其可能机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与耗材

采集足月产健康新生儿脐带，经产妇或家属签署知情同意书后获得，符合国家相关法律和伦理委员会规定。成脂、成软骨、成骨诱导试剂盒为美国Gibco公司产品；CCK8试剂盒为碧云天公司产品；MSCPhenotypingKit(CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP）为德国MiltenyiBiotec公司产品；油红O染液、Masson染液、茜素红S染液购自南京建成生物工程研究所有限公司；0.4%台盼蓝为美国Sigma公司产品；FBS、DMEM、0.25%Typsin-EDTA、L-谷氨酰胺、0.4μmol/Ltranswell小室为美国Gibco公司产品；Trizol溶液、cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒购自美国Lifetechnologies公司；基因引物为美国Invitrogen公司产品；青霉素-链霉素溶液购自德国PAN-biotech公司。

1.1.2仪器

VarioskanLUX多功能酶标仪和ST-16R低温离心机购自美国Thermo公司；steponeplus实时荧光定量PCR仪购自美国Life公司；1800系列-190气相液氮罐购自美国MVE公司；自动细胞计数仪购自美国Invitrogen公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1hucMSCs的分离培养

无菌条件下取脐带华通胶剪碎成约2mm3的组织块，加入II型胶原酶37℃恒温消化1.5h，收集滤液室温2000r/min离心10min，收集细胞沉淀加入含10%FBS的DMEM培养基重悬，置于37℃、5%CO2恒温培养箱内进行培养，待细胞融合度达到85%～90%时，用0.25%胰酶消化传代，接种密度为5×104/ml，每2天为细胞全量换液，每3～4天传代1次。

1.2.2hucMSCs表面抗原检测

参考文献[10]鉴定方法，取P3代对数生长期hucMSCs，用PBS调整细胞密度为5×106/ml，取1ml细胞，分别加入鼠抗人单克隆标记抗体CD90-PerCP-Cy5.5、CD105-PE、CD73-APC、CD45-/CD34-/CD14-/CD19-FITC，室温避光孵育30min，流式细胞仪上样检测。

1.2.3hucMSCs三向分化检测

参考文献[10]鉴定方法，取P3代对数生长期hucMSCs接种于六孔板中，细胞密度为5×104/ml,2ml/孔，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，待细胞融合度达到60%～70%时，弃去原培养基，分别更换为成脂、成软骨和成骨诱导分化培养基，每3天换液。诱导14d后，分别用油红O染液、Masson染液、茜素红S染液染色，倒置相差显微镜下观察细胞的成脂、成软骨、成骨分化情况。

1.2.4hucMSCs与HaCaTtranswell共培养

取HaCaT接种于六孔板中，接种密度为5×104/ml,2ml/孔。在HaCaT上方放置transwell小室，实验组transwell上室接种P3代hucMSCs，细胞密度为5×104/ml,1ml/孔，对照组的transwell上室添加等量DMEM培养基。每个处理组设置3个重复孔。在37℃、5%CO2细胞培养箱中连续培养24、48和72h，倒置显微镜下观察HaCaT的细胞形态。

1.2.5HaCaT增殖检测

参照1.2.4所述方法，于24孔板中接种并培养HaCaT和hucMSCs。培养结束后，弃去hucMSCs及小室，每孔加入200μlCCK8工作液，37℃孵育2h，酶标仪检测450nm处吸光值。

1.2.6划痕法检测HaCaT细胞迁移

按照1.2.4所述方法接种并培养HaCaT细胞。36h后，培养板孔底形成稀疏的单细胞层，用微量移液管尖在细胞中央作一个十字划痕，得到上、下、左、右四个无细胞的空白区域，并在四个象限区域的十字划痕上分别取点标记。用PBS洗涤细胞两次，去除HaCaT细胞碎片。接着，按1.2.4所述方法处理实验组和对照组细胞，用无血清DMEM培养基继续培养，在0、12和24h时显微镜观察相同位置划痕区弥合情况并拍照记录。迁移率计算方法为：12h或24h所测划痕区域与0h划痕区域的空白面积作差，差值除以0h测空白面积，所得百分比即12h或24h细胞迁移率。划痕实验每组设平行孔2个，独立重复3次实验。

1.2.7qRT-PCR检测基因mRNA表达

按照1.2.4所述方法培养HaCaT和hucMSCs，连续培养24、48h后，采用Trizol法提取HaCaT细胞总RNA，反转录为cDNA，–20℃保存。采用qRT-PCR测定HaCaT细胞纤连蛋白（Fibronectin）、基质金属蛋白酶-1(MMP-1）、I型胶原（CollagenI）、人角质细胞生长因子-2(KGF-2）、人成纤维细胞生长因子受体-2(FGFR-2）和转化生长因子-β1(TGF-β1）的mRNA表达。PCR扩增条件：50℃保持2min,95℃预变性2min,95℃变性3s,60℃退火30s，循环40次，95℃延伸15s,60℃延伸1min,95℃延伸15s。基因引物序列见表1。

1.3统计学分析

采用FlowJo7.6.1软件分析流式检测结果，GraphPadPrism6.0软件进行作图、统计学分析，ImageJ1.8.0进行细胞灰度分析，组间比较采用one-wayANOVA，数据用表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2、结果

2.1hucMSCs表面抗原鉴定

采用流式细胞术鉴定了P3代hucMSCs表面标志性抗原，图1显示CD45+/CD34+/CD14+/CD19+阳性细胞数百分比为0.35%,CD105+、CD90+、CD73+阳性细胞数百分比分别为98.35%、99.97%、99.94%（图1），符合国际细胞治疗学会定义的MSCs判定标准[11]。表明本研究采用的hucMSCs具有很好的MSCs生物学特性。

表1qRT-PCR基因引物序列

图1hucMSCs表面标志性抗原流式鉴定结果

2.2hucMSCs三向分化能力鉴定

P3代hucMSCs接种后12h贴壁良好，细胞呈典型成纤维细胞样生长，以放射状或平行状紧密排列，连续培养3d左右细胞密度达到85%～90%（图2A）。成脂诱导培养16d后进行油红O染色，观察到大小不等的红色脂滴，细胞核呈蓝色，脂滴随着诱导时长的增加而增大、增多，同时细胞形态从梭形、多角形向椭球形转变，表现出脂肪细胞特点；成骨诱导培养16d后进行茜素红S染色，观察到细胞体积增大，出现大量橘色沉淀颗粒和多层结节状结构，提示细胞出现钙化沉积，表现出成骨细胞特点；成软骨诱导培养16d后进行Masson染色，观察到细胞突起收回，趋向扁平圆形生长，细胞基质和纤维呈蓝紫色，表现出成软骨细胞样特点（图2B～D）。三向分化实验结果表明本研究制备的hucMSCs具有很好的成脂、成骨和成软骨分化潜能。

图2hucMSCs成脂、成骨、成软骨三向诱导分化结果

2.3hucMSCs共培养对HaCaT细胞形态的影响

对比hucMSCs共培养24、48和72h对HaCaT细胞形态和增殖状况的影响，结果显示培养24h时，HaCaT贴壁良好，细胞形态与轮廓清晰，共培养组较对照组细胞聚集更好、团块更大；48h时，共培养组细胞已联结成片、间隙大大缩小；72h时，共培养组细胞间隙消失，呈扁平铺路石状排列，较对照组细胞更紧密（图3）。提示与hucMSCs共培养的HaCaT细胞形态良好、增殖更快。

图3hucMSCs共培养对HaCaT细胞生长及形态的影响

2.4hucMSCs对HaCaT细胞增殖的影响

将hucMSCs处理组与对照组的A450作差，再与对照组A450作比，计算HaCaT细胞存活率的增加比例。结果显示（图4、表2),hucMSCs与HaCaT共培养24、48和72h,HaCaT细胞存活率分别显著增加了20.42%(P<0.01）、36.30%(P<0.01）和27.31%(P<0.05），与形态学观察结果（图3）一致。提示hucMSCs共培养能够持续促进HaCaT细胞的增殖。

图4HaCaT细胞CCK8增殖检测结果（*P<0.05,**P<0.01)

表2HaCaT存活率分析

2.5hucMSCs对HaCaT细胞迁移的影响

细胞划痕实验结果显示，HaCaT细胞对照组和共培养组初始空白区域面积分别为（44458.37±1838.50）μm2和（42080.05±2895.85）μm2，无显著差异（P>0.05，图5B）；继续培养12和24h，对照组与hucMSCs共培养组细胞均向划痕处迁移（图5A）。12h时，对照组和hucMSCs处理组的空白区域面积分别为（36354.19±1705.32）μm2和（29497.63±1286.49）μm2，迁移率分别为18.23%和29.90%，差异显著（P<0.05，图5B）；培养24h时，对照组空白区域面积为（13086.65±1695.85）μm2，迁移率为70.56%，共培养组空白区域面积为（2895.69±224.32）μm2，迁移率为93.12%，划痕处几乎已经重新铺满细胞，空白区域面积差异显著（P<0.05，图5B）。表明hucMSCs能够显著促进HaCaT细胞的迁移，加速划痕空白区域弥合。

图5hucMSCs共培养对HaCaT细胞迁移的影响

2.6hucMSCs对HaCaT细胞外基质蛋白和生长因子基因表达的影响

本研究进一步测定了hucMSCs共培养24和48h时HaCaT细胞迁移、黏附相关细胞因子及细胞外基质相关蛋白的mRNA表达水平，初步探究hucMSCs的作用机制。结果显示，与对照组相比，hucMSCs共培养48h显著提高了Fibronectin(P=0.013，图6A）和FGFR-2(P=0.011，图6E）的基因表达水平；共培养24h、48h,KGF-2(P=0.033和P=0.022，图6D）和TGF-β1(P=0.023和P=0.033，图6F)mRNA水平都得到显著提高；共培养48h,MMP-1(P=0.020，图6B)mRNA表达显著降低；共培养24h、48h,CollagenI(P=0.686和P=0.315，图6C）的基因表达水平均无显著变化。这些结果提示hucMSCs可能通过上调促HaCaT黏附、迁移及增殖相关生长因子表达，维持细胞外基质蛋白水平来促进角质形成细胞的迁移和增殖。

图6HaCaT细胞外基质蛋白及细胞生长因子基因表达检测结果

3、讨论

创伤愈合长期以来是行外科手术或烧灼伤后的临床关注重点，它与手术后感染、并发症，烧灼伤患者病程长短、后期瘢痕形成等均有密切关系。伤口愈合是一个高度复杂的过程，涉及多种生化途径和细胞活动，主要包括炎症反应、上皮再生、纤维增生和血管生成[12]。在愈合的早期阶段，表皮中主要的细胞类型角化形成细胞被激活，在上皮-间质转化的同时迁移到创伤部位并启动再上皮化和诱导伤口收缩，接着进行细胞增殖以重建复层上皮，因此，角质形成细胞对于伤口的最佳闭合至关重要[13]。Guerid等[14]在前瞻性随机临床试验中，用角化细胞悬浮液处理整形手术后人前大腿内侧皮肤，发现能够显著减轻伤口痛感、缩短愈合时长，并指出其可能通过释放生长因子或原位增殖来诱导和刺激愈合。Horváth等[15]研究发现，肌球蛋白磷酸酶通过不同程度地激活角质形成细胞的迁移和分化，促进HaCaT划痕伤口修复，帮助维持皮肤的正常稳态。Shibata等[2]研究也表明，脂联素在ERK信号通路的介导下通过促进角化细胞的增殖和迁移加速皮肤伤口愈合进程。这些研究结果表明，角质形成细胞的增殖和迁移与皮肤创伤愈合密切相关。由于在正常生理状态下，角质形成细胞是形成复层上皮的典型，其在创伤愈合时的迁移运动则以侧向爬行为主，因此，我们用基于无血清培养的划痕实验模拟探究hucMSCs对24h周期内HaCaT细胞迁移的影响。结果显示，hucMSCs共培养12、24h均显著提高HaCaT细胞的迁移率。CCK8存活率检测结果也显示，hucMSCs非接触处理24、48和72h均能显著提高HaCaT细胞的存活率。这些结果表明，hucMSCs能够有效提高HaCaT细胞的增殖和迁移能力，提示脐带源MSCs能够潜在地促进皮肤伤口愈合。

细胞外基质及其与细胞间复杂的信号传导与细胞黏附、迁移、生长等代谢活动相关。ECM可以影响角质形成细胞活性，并通过胶原酶分泌和整合素受体通路调节细胞迁移，进而参与皮肤损伤愈合和组织再生[16]。纤连蛋白是角质形成细胞特异性黏附和迁移的重要底物，以时间和剂量依赖方式发挥作用，同时也是表皮再植和皮肤损伤修复过程中影响上皮细胞迁移的关键蛋白[17]。本研究结果显示hucMSCs在促进HaCat细胞迁移的同时，显著上调了纤连蛋白的mRNA表达，且呈现时间依赖性，提示纤连蛋白可能是hucMSCs影响HaCaT细胞迁移的重要蛋白，与Clark等[17]结果一致。胶原是哺乳动物细胞ECM的重要组成部分和主要结构蛋白，能够促进ECM的成熟、加强和支持结缔组织，也是皮肤刚性和抗张强度的生物学基础。胶原在多种正常生理过程和病理条件下会被MMPs降解，包括组织重塑、器官形成、伤口愈合、皮肤老化和炎症发生等[18]。MMPs则主要通过裂解包括胶原蛋白在内的ECM组分而在组织重塑过程中发挥重要作用。其中，MMP-1是裂解I～III型胶原三重螺旋结构的主要酶。在皮肤炎性反应或辐照损伤条件下，细胞MMP-1水平的升高和I型前胶原蛋白水平降低，可以引发结缔组织损伤并加速皮肤老化[19]。本研究结果显示，hucMSCs共培养能够显著下调HaCaT细胞MMP-1的mRNA水平，而I型胶原蛋白表达无显著变化，提示间充质干细胞通过抑制I型胶原蛋白和纤连蛋白的降解，进而促进角质形成细胞的迁移活动。

可溶性生长因子及其受体间相互作用也被认为是皮肤细胞增殖、迁移活动及伤口愈合各阶段的重要调节因子，包括转化生长因子β，角质细胞生长因子及其受体，成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等[20,21]。TGF-β是常见的细胞因子，Grose等[22]和O′Leary等[23]研究发现，TGF-β1可以通过上调特定整合素的表达促进角质细胞的迁移和运动，并促进皮肤细胞增殖，最终加速皮肤创伤愈合。与之相一致地，我们发现hucMSCs共培养24h和48h后TGF-β1的mRNA表达分别上调为对照组的1.92倍和2.26倍，呈现时间依赖效应，提示hucMSCs促进HaCaT的增殖和迁移可能与TGF-β通路的激活有关。KGF-2是人体皮下组织细胞分泌的一种重要生长因子，能够特异性结合上皮细胞的FGFR-2，再经过一系列信号传递过程促进上皮细胞的增殖、分化和迁移[24]。在动物模型中，KGF-2能够显著促进皮肤移植、机械损伤造成的创面愈合，提高新生皮肤胶原含量，增加皮肤抗张强度和上皮厚度[25,26]。本研究结果也显示，hucMSCs显著上调HaCaT细胞KGF-2的mRNA表达并呈时间效应关系，在共培养处理48h后其特异性受体FGFR-2mRNA水平也显著上调1.34倍，提示KGF-2及其受体参与hucMSCs对HaCaT增殖和迁移的调节作用。

近年来，越来越多研究指出，MSCs在皮肤医学领域应用前景广阔，除了具有降低炎性反应[27]、缓解纤维化[8]、减轻瘢痕形成[28]等作用，还被发现能够促进皮肤损伤愈合，是有潜力的皮肤创面移植材料。Rashtbar等[29]研究表明，添加了MSCs的绵羊小肠黏膜下层细胞外基质材料与不添加MSCs相比，能够更有效地促进大鼠创伤皮肤的上皮形成、伤口收缩和愈合。Pérez-Díaz等[30]则基于脂肪源MSCs开发了纳米级抗生物膜细胞敷料，可以有效减少皮肤水分流失、防止细菌感染和促进创伤部位皮肤再生。Martinello等[31]从外周血中提取MSCs，用于处理手术造成的绵羊皮肤伤口，使得伤口边缘皮肤细胞增殖更快，加速创伤部位肉芽组织、新生血管、结构蛋白和皮肤附件的形成与成熟，同时不会引起炎症反应，指出MSCs对大型哺乳动物表皮和全层皮肤创伤均具有很好的修复作用。值得一提的是，MSCs在皮肤上尤其是真皮层的移植植入率低，原位增殖和分化细胞有限，其对皮肤的有益作用更可能通过旁分泌作用和产生免疫调节因子来实现[32,33]。

综上，我们研究发现hucMSCs能够在非物理接触情况下有效促进HaCaT的增殖与迁移，这可能与其对细胞外基质蛋白、细胞增殖与迁移相关生长因子的mRNA表达调控有关，包括上调纤连蛋白、下调MMP-1基因表达，并维持I型胶原蛋白的mRNA水平，同时，不同程度地上调TGF-β1、KGF-2及FGFR-2的mRNA水平，呈时间依赖效应，这些结果提示hucMSCs是促进表皮创伤愈合的有潜力的种子细胞。接下来，我们将在3D皮肤模型及动物模型上进一步探究hucMSCs促进角质形成细胞增殖和迁移的作用方式及分子机制，为开发基于hucMSCs的皮肤伤口愈合敷料提供数据支持。

参考文献：

[10]章毅,陈侃俊,李萍,等.程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响.中国医药生物技术,2017,12(6):513-519.

章毅,陈侃俊,伍婷,张晗,祁成,孔凡瑞,陈亮,胡肖希,李品宙.人脐带间充质干细胞对HaCaT细胞增殖与迁移的影响[J].中国医药生物技术,2020,15(03):260-268.