乳腺增生又称乳腺结构不良，是乳腺导管、腺泡或纤维组织过度增生而复旧不全形成的非炎症非肿瘤良性增生，主要临床表现为乳房疼痛和肿块。MGH有一定的癌变倾向，癌变率2%左右[1]；有文献报道，被诊断为非典型性乳腺增生的患者7年累计癌变率为9.9%[2]。MGH占所有乳腺疾病的70%，是女性乳腺最为高发的疾病，且其发病率呈逐年上升趋势[3]。因此，防治MGH对于预防乳腺癌的发生具有积极意义。目前，有关电针治疗MGH的研究较多，但部分患者惧怕电针治疗。艾灸作为另一种常用的穴位刺激疗法，可替代、补充电针治疗，同时，也更适用于不能够接受电针治疗的患者。近年研究发现，艾灸过程可产生“灸感”，提示艾灸和针刺类似，均可通过疏通经脉达到调整阴阳、防治疾病的目的[4,5]。本研究观察艾灸对MGH模型大鼠的干预效果，以及其对MGH模型大鼠血清雌二醇（E2）、孕激素（P）水平和乳腺组织雌激素受体α（ERα）、孕激素受体（PR）蛋白表达的影响，探索艾灸治疗MGH的疗效和作用机制，报道如下。

1、实验材料

1.1实验动物

雌性成熟未孕SD大鼠40只，体质量200～220g,50～60日龄，购于西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2012-003。

1.2主要试剂与仪器

苯甲酸雌二醇注射液（浙江省宁波市第二试剂厂，批号110202511），高效RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号20170118），蛋白酶抑制剂（博士德生物工程有限公司，批号lot13E23C92），β-actin内参抗体[爱必信（上海）生物科技有限公司，批号12-7311]，孕激素受体抗体（北京凯德生物公司，批号bs-23376R），雌二醇受体抗体（北京凯德生物公司，批号bs-0122R），兔二抗（北京凯德生物公司，批号bs-0295G-HRP）。

ELx808型酶标仪（上海拜力生物科技有限公司），TC-120S型智能程控生物组织自动脱水机（湖北泰维科技实业有限公司），TB-718EL型生物组织自动包埋机（湖北泰维科技实业有限公司），轮转切片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司），TK-218型恒温摊片烤片机（湖北泰维科技实业有限公司），LGJ-12型真空冷冻干燥机（北京松原华兴科技公司），MAGPIX型液相芯片检测平台（美国Luminex公司），5417R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），MiniTrans-Blot转印系统（美国伯乐），凝胶成像分析系统（美国伯乐），研究级正置数码显微镜（尼康）等。

2、实验方法

2.1分组与造模

40只大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为空白组、模型组、艾灸组和电针组，每组各10只。除空白组外，其他3组大鼠均通过注射苯甲酸雌二醇建立MGH模型。造模操作如下：于大鼠大腿外侧肌肉处隔天交替注射苯甲酸雌二醇，注射剂量为0.5mg/kg，每日注射1次，连续注射30d。空白组大鼠按同样操作方法注射等量0.9%氯化钠溶液，每日注射1次，连续注射30d。30d后，从各组分别随机选取2只大鼠进行MGH模型评价，通过HE染色观察空白组与其他3组大鼠乳腺组织形态差异，确定造模成功。

2.2干预方法

2.2.1选穴和定位

艾灸组、电针组干预穴位均分为甲、乙两组，甲组为天宗、肝俞、足三里，乙组为合谷、屋翳、膻中，除膻中外，其他穴位均取双侧。穴位定位参照《实验针灸学实验指导》相关内容[6]。各穴位定位和针刺方法为：天宗在肩胛下窝中央，直刺6mm；肝俞在第9胸椎下两旁肋间，直刺6mm；足三里在膝关节后外侧，腓骨小头下约5mm处，直刺7mm；合谷在前肢第1、2掌骨间，直刺1mm；屋翳在第2肋间，胸前正中旁开5mm，直刺1.5mm；膻中在前正中线上，平第4、5肋间，直刺1.5mm。

2.2.2干预操作

分别对艾灸组和电针组大鼠进行艾灸和电针干预，每次干预前先用脱毛膏对要干预的穴位处进行脱毛处理，以充分暴露穴位为宜。艾灸、电针组大鼠甲乙两组穴位隔日交替干预，每连续干预5d休息2d为1个周期，连续干预4个周期。艾灸组干预操作：将大鼠捆绑固定在自制木板上，完全暴露干预穴位，并安抚大鼠使其安静。将点燃的细艾条固定放置在穴位正上方2cm处施灸，每穴艾灸时间约2min，每日艾灸1次。电针组干预操作：用与艾灸组同样的方法将大鼠固定于自制木板上，完全暴露穴位，并安抚大鼠使其安静。常规进针后，双侧天宗、肝俞、合谷、屋翳分别连接电针仪。调节频率为2Hz，选择连续波，每次电针10min，每日电针1次。

空白组和模型组大鼠以与艾灸组、电针组同样的方式进行捆绑固定，完全暴露穴位，并安抚使其安静，不进行其他干预，每次捆绑固定10min，每日1次。

2.3指标检测

2.3.1乳头高度与直径

分别于造模前，造模后、干预前，干预后测量各组大鼠乳头高度与直径。每次测量前，所有大鼠断食断水1d。次日，用脱毛膏对大鼠的第2对乳房周围半径1cm部位进行脱毛，充分暴露乳房，用游标卡尺测量每只大鼠第2对乳头的高度和直径。

2.3.2乳腺组织与血清标本采集

干预后，待各组大鼠乳头高度与直径测量完毕，通过10%水合氯醛腹腔注射对大鼠进行麻醉，剪取大鼠第2对完整乳房，每个标本组织块的一部分过液氮，保存在-80℃冰箱中备用，另一部分放入4%多聚甲醛溶液中保存。腹主静脉采血，离心取血清并保存在-80℃冰箱中备用。

2.3.3乳腺组织形态观察

干预后，对各组大鼠乳腺组织切片进行常规HE染色，置于光学显微镜下观察乳腺导管、腺泡形态学变化。

2.3.4高通量液相芯片技术检测大鼠血清E2、P水平

取出血清样品并平衡至室温；先后向微型管中加入250μL血清、375μL乙腈，震荡5s后于室温下放置10min；用离心机以17000r/min的速度离心5min，离心半径为40cm，得上清液，移出500μL上清液到另一微型管中；用真空冷冻干燥机对移出的上清液进行冻干处理，冻干后-20℃保存备用；用200μL缓冲液（AssayBuffer）稀释冻干样品，震荡10min，得到冻干上清液；分别向96孔板加入200μLAssayBuffer，室温震荡10min后甩干；先后向每孔加25μLAssayBuffer，向标准品孔加25μL标准品，向样品孔中加25μL冻干上清液，向每孔加25μL辣根过氧化物酶（HRP），向每孔加25μL抗体磁珠，然后4℃震荡孵育18h；倒出内容物并拍干，每孔加200μL洗涤液，洗4片；每孔加25μL抗体，室温下震荡1h；每孔加25μL链霉亲和素藻红蛋白，室温下孵育0.5h；甩干内容物，每孔加200μL洗涤液，洗涤2片；每孔加100μL鞘液后，在液相芯片检测仪上读板，获取实验数据。

2.3.5免疫印记法检测大鼠乳腺组织ERα、PR蛋白表达

(1)匀浆：采用BCA法进行蛋白定量，将蛋白含量调至10μg/μL，制备好上样蛋白。(2)制胶：10%分离胶和5%浓缩胶。(3)电泳：先用恒压90V电泳20min左右，直到蛋白跑出两胶的分隔线，然后换成恒压120V电泳2～2.5h。(4)转膜：恒定电流380mA转膜1h。(5)封闭：5%脱脂牛奶封闭1h。(6)孵一抗：内参蛋白的一抗β-actin，其目标蛋白一抗分别为孕激素受体抗体和雌二醇抗体受体，以5%脱脂牛奶稀释1000倍，置于4℃环境中过夜。(7)孵二抗：以5%脱脂牛奶稀释5000倍，静置1.5h。(8)凝胶成像分析系统中发光照相。

2.4统计学方法

采用SPSS25.0软件进行数据的统计学分析，计量资料以表示，采用单因素方差检验，取α=0.05为检验水准。

3、实验结果

3.1各组大鼠乳头高度和直径比较

造模前，各组大鼠乳头高度比较，差异无统计学意义（P>0.05）；造模后、干预前，模型组、艾灸组、电针组大鼠乳头高度明显高于空白组，差异有统计学意义（P<0.01）。干预后，艾灸组和电针组大鼠乳头高度明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；艾灸组和电针组大鼠乳头高度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1各组大鼠干预前后乳头高度比较

造模前，各组大鼠乳头直径比较，差异无统计学意义（P>0.05）；造模后、干预前，模型组、艾灸组、电针组大鼠乳头直径明显大于空白组，差异有统计学意义（P<0.01）。干预后，艾灸组和电针组大鼠乳头直径明显小于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；艾灸组和电针组大鼠乳头直径比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2各组大鼠干预前后乳头直径比较

3.2各组大鼠乳腺组织形态比较

空白组大鼠乳腺导管无扩张且管腔内无分泌物，导管上皮细胞排列规则，乳腺腺泡数量及体积大小正常，乳腺小叶体积及数目均正常。模型组大鼠乳腺导管直径变大且管腔形态不规则，导管上皮细胞明显增生且排列不规则，腔内有部分脱落组织和分泌物，腺泡数量明显增多且体积扩大，腺上皮细胞乳头状增生明显，乳腺小叶体积增大、数量显著增多。与模型组比较，艾灸组、电针组大鼠乳腺导管直径均显著缩小，乳腺导管管腔形态相对规则，管腔内脱落组织和分泌物显著减少或消失，乳腺导管上皮细胞数目减少且排列相对规则，乳腺腺泡及乳腺小叶数量均明显减少。见图1。

图1各组大鼠乳腺组织形态（HE染色，200×）

3.3各组大鼠血清E2、P水平比较

干预后，模型组大鼠血清E2水平明显高于空白组，血清P水平明显低于空白组，差异均有统计学意义（P<0.01）。艾灸组和电针组大鼠干预后的血清E2水平明显低于模型组，血清P水平明显高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。艾灸组与电针组大鼠干预后的血清E2、P水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3各组大鼠干预后血清E2、P水平比较

3.4各组大鼠乳腺组织ERα、PR蛋白表达比较

干预后，模型组大鼠乳腺组织ERα、PR蛋白表达明显高于空白组，差异有统计学意义（P<0.01）；艾灸组和电针组大鼠乳腺组织ERα、PR蛋白表达明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；艾灸组和电针组大鼠乳腺组织ERα、PR蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4、图2。

4、讨论

《医学入门》曰：“凡病药之不及，针之不到，必须灸之”，说明艾灸同药物、针刺一样，也是治疗疾病的重要手段。目前，在MGH的临床治疗中，电针疗法应用较广，但部分患者惧怕电针治疗，故我们进一步研究艾灸治疗MGH的疗效与机制。

表4各组大鼠干预后乳腺组织ERα、PR蛋白表达比较

图2各组大鼠干预后乳腺组织ERα、PR蛋白表达

乳头高度和直径可以在一定程度上反映乳腺导管长度和直径的变化。大鼠第2对乳房在位置上和人类乳房最为接近，能更近似地反映出人类乳腺生理和病理学变化，故本研究选择大鼠第2对乳头高度、直径作为艾灸治疗MGH疗效的参考指标。研究显示，艾灸组大鼠经艾灸干预后，乳头高度显著降低，乳头直径显著减小，且这种变化和电针组比较，差异无统计学意义，提示艾灸对MGH模型大鼠有较好疗效，且该疗效和电针治疗类似。乳腺组织形态观察发现，模型组大鼠乳腺导管上皮细胞排列紊乱，乳腺导管扩张，乳腺小叶数量增多、体积增大；艾灸组大鼠经艾灸干预后，乳腺导管及乳腺小叶的增生程度得到显著改善，且改善程度和电针组类似，亦表明艾灸可在MGH治疗中发挥积极作用。

雌激素分泌绝对增高或相对于孕激素分泌增高是MGH发生的主要病因，过量的雌激素刺激乳腺组织增生，同时低分泌的P对乳腺的保护作用减弱，导致乳腺组织增生过度而复旧不全，最终形成MGH。E2为雌激素发挥生物活性的主要成分，P在雌激素作用基础上进一步促进乳腺腺泡发育，E2与P水平维持一定比例是乳腺正常增生和复旧的前提，因此本实验选择E2和P作为观察指标。实验显示，模型组大鼠血清E2水平较空白组明显升高，血清P水平较空白组显著下降，这也印证了E2与P比例失调是MGH的重要诱因。艾灸组大鼠经过艾灸干预后，血清E2水平下降、P水平上升，且这种变化与电针组比较，差异无统计学意义，提示艾灸对MGH模型大鼠性激素水平有一定的调节作用，这与我们此前研究发现的针刺作用一致[7]。由此推测，艾灸可能通过上调E2水平、下调P水平达到治疗MGH的效果。

E2、P分别与ERα、PR结合方可发挥生物学效用，有文献表明，乳腺组织ERα、PR蛋白表达上调是MGH的重要病因，且乳腺增生越严重这两种受体蛋白表达越高[8]。雌激素过多分泌是乳腺组织ERα、PR过高表达的重要诱因[9]。过多分泌的E2刺激乳腺组织中ERα表达升高，使乳腺组织对E2的敏感性增强，导致乳腺导管上皮和乳腺腺泡增生，最终使乳腺小叶体积增大、数量增多，形成MGH。而且，没有完全复旧的增生乳腺组织通过干扰人体性激素的分泌，导致乳腺组织ERα的合成增加，而作为ERα合成必不可少的PR蛋白，其表达量也会随之增多。因此，E2的分泌量增多将导致ERα和PR的表达上升，反之，E2的分泌量下降，将使这两种受体表达下降。本实验通过免疫蛋白印迹法检测各组大鼠乳腺组织中ERα、PR蛋白表达情况，发现与空白组比较，模型组大鼠这两种受体蛋白表达均显著升高，说明ERα、PR的高表达是MGH的重要特点，同时也间接肯定了选择ERα、PR作为疗效观察指标的科学性。艾灸组大鼠经艾灸干预后，乳腺组织中ERα、PR蛋白表达较模型组显著降低，且这种变化与和电针组比较，差异无统计学意义。结合艾灸治疗后MGH模型大鼠E2水平显著下降这一结果，我们认为艾灸可能通过降低E2水平以纠正性激素分泌紊乱，进而下调乳腺组织ERα、PR蛋白表达，从而起到治疗MGH的作用。

参考文献：

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[6]郭义,方剑乔.实验针灸学实验指导[M].3版.北京:中国中医药出版社,2012:46-48.

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