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卵巢子宫内膜异位症患者miR-200c和ZEB1基因表达及其临床意义

2023-10-27 81 上传者：管理员

摘要：目的探讨卵巢子宫内膜异位症（EMs）患者微小RNA(miR)-200c和E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)基因表达及其临床意义。方法收集2022年1月至2022年6月在石家庄市人民医院手术治疗的卵巢EMs患者异位、在位内膜组织各50例；选取同期由于宫颈上皮内瘤样病变（CIN）Ⅲ行全子宫切除术患者的子宫内膜组织50例作为对照组。采用实时荧光定量PCR法测定miR-200c和ZEB1基因表达；采用免疫组化法测定ZEB1蛋白表达。比较各组miR-200c和ZEB1相对表达量；比较各组ZEB1蛋白阳性率；分析miR-200c与ZEB1相关性；分析miR-200c和ZEB1与卵巢EMs关系。结果异位内膜组miR-200c和ZEB1相对表达量高于在位内膜组和对照组（P<0.05）；在位内膜组miR-200c和ZEB1相对表达量高于对照组（P<0.05）。异位内膜组ZEB1蛋白阳性率高于在位内膜组和对照组（P<0.05）；在位内膜组ZEB1蛋白阳性率高于对照组（P<0.05）。经Pearson分析显示，miR-200c与ZEB1呈线性正相关（P<0.05）。经多因素Logistic回归分析显示，miR-200c和ZEB1为影响卵巢EMs的危险因素。结论卵巢EMs患者miR-200c和ZEB1基因呈高表达，在卵巢EMs发生、发展中具有重要作用，且为影响卵巢EMs的危险因素。

关键词：
E盒结合锌指蛋白1
卵巢子宫内膜异位症
微小RNA-200c
月经不调
靶点治疗
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卵巢子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）是妇科最常见的疾病之一，约10%育龄期女性罹患此病，且其发病率呈逐年上升趋势[1]。EMs患者常伴有月经不调、痛经和不孕等症状，严重影响了女性的生活质量[2]。目前临床上治疗EMs的方法包括手术、药物及两者联合治疗，治疗效果不理想，且复发率高[3,4]。因此，进一步研究EMs的发病原因、阐明其发病机制，通过靶点治疗EMs已成为妇科研究的焦点。微小RNAs(microRNAs,miRNAs）是一类长19～25个核苷酸的内源性非编码RNA分子，通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而调控靶基因表达来发挥作用。近年来研究发现EMs患者异位内膜组织中存在多个异常表达的miRNAs，提示miRNAs可能参与EMs发病[5]。miR-200c是与细胞迁移、上皮-间质转化相关的重要分子，目前关于miR-200c与卵巢EMs间研究甚少。E盒结合锌指蛋白1(E-box binding zinc finger protein1,ZEB1）属锌指同源结构域转录因子，是一种位于10号染色体上的进化相对保守的转录因子，近年来，研究发现ZEB1与恶性肿瘤发生关系紧密，但目前关于ZEB1与卵巢EMs间方面研究甚少，具体作用机制尚未完全明确，缺乏可靠的临床参考价值[6]。鉴于此，本研究探讨卵巢EMs患者miR-200c和ZEB1基因表达及其临床意义，以期为临床诊断和治疗卵巢EMs提供参考。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2022年1月至2022年6月在石家庄市人民医院手术治疗的卵巢EMs患者异位、在位内膜组织各50例，年龄21～40岁，平均（32.71±5.42）岁；体质量指数15～23 kg/m2，平均（19.13±1.76)kg/m2。选取同期由于宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）Ⅲ行全子宫切除术患者的子宫内膜组织50例作为对照组，年龄20～42岁，平均（33.21±4.37）岁；体质量指数14～22 kg/m2，平均（18.78±2.45)kg/m2。各组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。研究经石家庄市人民医院医学科研伦理委员会审批通过（2021117）。

纳入标准：经术后病理证实为卵巢EMs；依据美国生育学会修正的分期标准（American Fertility Society,AFS）分期Ⅲ、Ⅳ期卵巢EMs；获得知情同意。

排除标准：由于配偶生殖功能障碍、输卵管因素等造成不孕者；合并其他内分泌系统疾病者；恶性肿瘤者；重要脏器功能障碍者；精神疾病者。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量聚合酶链反应（polymerasechain reaction,PCR）法测定miR-200c和ZEB1基因表达

采用TRIzol试剂提取上述组织总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA），取5μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳并检测总RNA的纯度和完整度。按照反转录试剂盒（美国Biomiga公司）使用说明书将其反转录为单链脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,cDNA），以GAPDH作为内参基因，检测miR-200c和ZEB1基因表达。取cDNA进行实时荧光定量PCR，反应条件：95℃预变性10 min,95℃、15 s、60℃、1 min，共完成40个循环，每个样品设置3个复孔。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2‒ΔΔCt法计算miR-200c和ZEB1相对表达量。引物序列见表1。

表1引物序列

1.2.2免疫组化法测定ZEB1蛋白表达

采用免疫组织化学法测定ZEB1蛋白表达。鼠抗人ZEB1多克隆抗体（英国Abcam公司），免疫组化（immunohisto chemistry,SP）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。具体方法：标本均经中性福尔马林固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片4μm。经60℃烤片切片30 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，采用3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，抗原采用柠檬酸钠缓冲液煮沸修复，放于室温环境下自然冷却。再以5%山羊血清室温封闭30 min，滴加ZEB1蛋白一抗，4℃孵育过夜。再滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，放置于37℃孵育20 min。采用DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。结果判定：每张切片随机选取200倍不重叠视野5个，计数阳性细胞数和细胞总数，统计阳性细胞比例。ZEB1蛋白定位于细胞核，主要呈浅黄色至棕黄色颗粒状。按照阳性细胞比例和染色强度评分乘积综合评价。阳性细胞比例：0分：无阳性细胞；1分：阳性细胞≤10%;2分：阳性细胞>10%～30%;3分：阳性细胞>30%～50%;4分：阳性细胞>50%。染色强度：0分：阳性细胞无着色；1分：阳性细胞浅黄色；2分：阳性细胞棕黄色；3分：阳性细胞棕褐色。以总分≤3分表示（-），以总分4～6分表示（+），以总分7～9分表示（++），以总分≥10分表示（+++）。

1.3观察指标

比较各组miR-200c和ZEB1相对表达量；比较各组ZEB1蛋白阳性率；分析miR-200c与ZEB1相关性；分析miR-200c和ZEB1与卵巢EMs关系。

1.4统计学处理

采用统计学软件SPSS 25.0数据处理，计量资料采用（±s）表示，两组计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用方差分析；计数资料采用百分率表示，比较采用χ2检验。采用Pearson分析miR-200c与ZEB1相关性。采用多因素Logistic回归分析miR-200c和ZEB1与卵巢EMs关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组miR-200c和ZEB1相对表达量比较

异位内膜组miR-200c和ZEB1相对表达量高于在位内膜组和对照组（P<0.05）；在位内膜组miR-200c和ZEB1相对表达量高于对照组（P<0.05）。见表2。

2.2各组ZEB1蛋白阳性率比较

异位内膜组ZEB1蛋白阳性率高于在位内膜组和对照组（P<0.05）；在位内膜组ZEB1蛋白阳性率高于对照组（P<0.05）。见表3和图1。

2.3 Pearson分析miR-200c与ZEB1相关性

经Pearson分析显示，miR-200c与ZEB1呈线性正相关（P<0.05）。见表4。

表2各组miR-200c和ZEB1相对表达量比较（±s)

表3各组ZEB1蛋白阳性率比较

图1各组ZEB1蛋白阳性表达（200×）

表4 Pearson分析miR-200c与ZEB1相关性

2.4多因素Logistic回归分析miR-200c和ZEB1与卵巢EMs关系

经多因素Logistic回归分析显示，miR-200c和ZEB1为影响卵巢EMs的危险因素。见表5。

表5多因素Logistic回归分析miR-200c和ZEB1与卵巢EMs关系

3、讨论

EMs是子宫内腺样上皮和间质在子宫外生长的一种良性疾病，最常见于卵巢[7,8]。卵巢EMs可造成性交困难、痛经、慢性盆腔疼痛及不孕，其特性与浸润性癌相似，如黏附性、侵袭性和转移潜能，可增加卵巢癌的发生风险。目前临床上治疗EMs的方法包括手术、药物以及两者的联合治疗。药物治疗只能暂缓症状，不能根除疾病，且副作用明显；手术治疗分为保守性手术和根治性手术两种，保守性手术术后复发率高，而根治性手术使患者丧失生育功能、提前进入更年期[9,10,11]。因此，进一步研究EMs的发病原因、阐明其发病机制，开辟更有针对性的治疗途径具有重要意义。

miRNAs是一类具有高度保守性、时序性及组织特异性的内源性非编码小分子单链RNA，通过与靶mRNA的3'UTR结合引起靶mRNA降解或抑制其翻译，在转录后水平负性调控靶基因表达，从而发挥相应的生物学功能。肿瘤领域方面，miRNAs在癌组织、癌前病变组织及正常组织中呈不同的表达谱，异常表达的miRNAs与肿瘤发生、发展、侵袭、转移及预后等密切相关，这为肿瘤早期诊断、分类、分级及预后评估提供了新的依据，为肿瘤治疗提供新的方案。EMs具有远处转移和种植生长等类似恶性肿瘤的生物学行为，其发生是多个基因参与的、错综复杂的调控网作用的结果。研究证实EMs患者异位病灶中存在多个异常表达的miRNAs，这些miRNAs通过调控靶基因的表达参与EMs发生和发展[12]。miR-200c是与细胞迁移、上皮-间质转化相关的重要分子，是近年来发现的与上皮-间质转化调控有关的miRNAs家族成员之一，低表达的miR-200c可增强子宫内膜间质细胞的侵袭及迁移能力，从而促进EMs发生[13]。本研究表明，异位内膜组miR-200c相对表达量高于在位内膜组和对照组，且在位内膜组高于对照组，由此可见卵巢EMs患者miR-200c基因呈高表达，且在异位内膜组织中表达最高；经多因素Logistic回归分析显示，miR-200c为影响卵巢EMs的危险因素。ZEB1位于人的第10号染色体上，是ZEB同源盒转录因子家族中一员，其主要结构由同源结构域和两侧的锌指N端簇和C端簇组成[14]。在胚胎发育中，ZEB1具有重要调节作用，其缺失或突变会造成严重的胚胎畸形。同时，ZEB1也为参与肿瘤进展的一种关键转录调节因子，并且在许多癌症中异常表达，能够促进肿瘤细胞的侵袭、转移[15,16]。本研究表明，异位内膜组ZEB1相对表达量和ZEB1蛋白阳性率高于在位内膜组和对照组，且在位内膜组高于对照组，由此可见卵巢EMs患者ZEB1基因呈高表达，且在异位内膜组织中表达最高；经多因素Logistic回归分析显示，ZEB1为影响卵巢EMs的危险因素。

综上所述，卵巢EMs患者miR-200c和ZEB1基因呈高表达，在卵巢EMs发生、发展中具有重要作用，且为影响卵巢EMs的危险因素。

参考文献:

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