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桑寄生-茯苓药对治疗膝骨关节炎作用机制网络药理学研究

2024-02-09 18 上传者：管理员

摘要：目的:基于网络药理学与分子对接技术探讨桑寄生-茯苓药对防治膝骨关节炎的潜在作用机制。方法:使用中药系统药理学分析平台(TCMSP)、Uniprot数据库收集桑寄生-茯苓活性成分及相关靶点；在GeneCards、DrugBank、OMIM数据库获取人类KOA相关基因；绘制药物疾病的Venn图，并取交集靶点。通过STRING构建蛋白互作(PPI)网络、用Cytoscape绘图并筛选核心靶点。再通过DAVID数据库进行基因本体论GO富集分析，京都基因与基因组百科全书KEGG富集分析。并利Cytoscape软件构建药物疾病相互作用网络。最后运用PyMOL、AutoDock Tools软件进行分子对接预测。结果:桑寄生-茯苓药对治疗KOA活性成分有槲皮素、蛇床素；药物与KOA的共同靶点有89个，核心靶点为肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL6)、RACα丝氨酸/苏氨酸蛋白(AKT1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞肿瘤抗原p53等；富集分析主要通路有PI3K-Akt、TNF、IL-17等信号通路。分子对接显示槲皮素与核心靶点对接结合能均<-5.0 kcal/mol。结论:桑寄生-茯苓药对中槲皮素、蛇床素活性成分通过TNF、IL6、AKT1、VEGFA、TP53等核心靶点与PI3K-Akt、TNF、IL-17信号通路参与治疗KOA。

关键词：
分子机制
桑寄生
网络药理学
膝骨关节炎
茯苓
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膝骨关节炎(Knee osteoarthritis, KOA)好发于年老群体，以膝关节疼痛、功能障碍为主要表现[1,2]。基于人口老龄化现状，KOA发病率越来越高[3]。对于KOA的防治，提倡早发现早治疗，阶梯治疗。早期可以使用营养软骨、止痛等药物缓解病症；而终末期KOA患者，多考虑手术治疗，包括关节融合、关节置换术等术式[2]。由于KOA病程长，病情反复，患者生活质量逐渐下降，对家庭和社会也造成巨大的经济负担[4,5]。中医药在膝骨关节炎的防治中成效显著，在临床广泛运用[6]。

KOA属于中医“痹症”范畴，在《膝骨关节炎(膝痹)中西医结合临床实践指南》[7]中直接将KOA称为“膝痹”,其病因与年龄、外感、劳损等相关。病机以肝肾不足为本；匮及卫阳，风寒湿邪杂滞为标，表现为痹、痛[8]。久病累及后天之本，脾虚易生痰湿之邪。桑寄生可祛风湿、强筋骨、补肝肾；茯苓可健脾、利水渗湿。二药合用可以补肝肾治先天，健脾以治后天；补肝脾肾治本，祛湿治标。桑寄生-茯苓药对是众多名老专家治疗KOA使用频率较高的药对[9],但缺少相关作用机制研究。网络药理学可直观体现药物与疾病在分子层面的潜在联系，对药物作用于疾病的关键靶点进行预测分析，为桑寄生-茯苓药对临床应用新药研发提供前期依据。

1、材料与方法

1.1 工具

本研究主要使用数据库及软件包括中药系统药理学分析平台(TCMSP 2.3)、UniProt数据库、GeneCards数据库;DrugBank数据库;OMIM数据库;Draw Venn Diagram ;STRING数据库11.5;Cytoscape 3.9.1;DAVID平台;微生信;PDB数据库;PyMOL;AutoDock Tools 1.5.7等。

1.2 活性成分及靶点筛选

在TCMSP分别检索桑寄生和茯苓得到各自的已知活性分子；类药性DL≥0.18、口服生物利用度OB≥30%排除与本研究无关成分；将符合条件成分汇总，再通过成分特有的Mol编码手动搜索每个成分作用蛋白靶点并配对。在Uniprot数据库搜索获取人类基因库的Excel文档，利用Excel函数功能将TCMSP获得的蛋白靶点转化为Uniprot基因名，显示错误的靶点则直接在Uniprot检索，汇总后去重。

1.3 KOA靶点获取

使用官方检索词，在GeneCards、DrugBank、OMIM平台检索人类KOA相关基因，将搜索结果汇总，再去除重复基因。

1.4 桑寄生-茯苓药对与KOA交集靶点获取

将上文获得的药物靶点与疾病基因载入Draw Venn Diagram-Universiteit Gent绘制Venn图。并用Excel表格函数公式取得交集靶点。

1.5 核心靶点筛选

交集靶点用STRING做蛋白互作(PPI)网络，最低互动分0.7,输出TSV文件，再导入Cytoscape中，用“Network Analyzer”插件计算每个靶点Degree(度值),根据Degree降序排序筛选核心靶点。

1.6 富集分析

DAVID平台对交集靶点做GO、KEGG分析。GO分析均选择前10条，KEGG分析选择前20条。

1.7 药物与疾病通路关系的网络构建及首要活性成分筛选

依据上文建立节点关系和属性的EXCEL文件，分别将关系和属性文件导入Cytoscape绘制“药物-成分-靶基因-通路”网络图。并用“Network Analyzer”插件对节点度值进行计算，再导出文件，对度值进行排序筛选出首要成分及对应的靶基因。

1.8 分子对接

使用PDB数据库搜索筛选出的核心靶点，并获取相关蛋白3D结构，用PyMOL软件去水、选取单链，再用AutoDock Tools加氢、设置为受体并导出pdbqt格式；从TCMSP平台下载上文中筛选的首要活性成分的mol2文件，AutoDock Tools加氢、改配体、定义扭转键并导出pdbqt格式。用AutoDock Tools设置对接盒子、移出配体、输出结果、运行Autogrid、设置参数方法、运行Autdock、查看结果；PyMOL可视化。

2、结果

2.1 活性成分及作用靶点

通过TCMSP预测的桑寄生-茯苓药对活性成分共80种，桑寄生有46种，茯苓有34种；均通过OB≥30%、DL≥0.18的条件筛选，并去除没有靶蛋白的成分，最终确定活性成分桑寄生2种、茯苓6种，见表1。并通过Uniprot数据库转化获取桑寄生-茯苓对应的靶基因共164个。

表1桑寄生-茯苓活性成分

2.2 人类KOA靶基因预测

汇总GeneCards、DrugBank、OMIM数据库获取的人类KOA相关基因，并去重，获得疾病靶基因共1 316个。

2.3 药物与疾病交集靶基因筛选

使用Draw Venn Diagram-Universiteit Gent平台绘制药物与疾病的Venn图，见图1。使用Excel函数公式获得具体的交集靶基因共89个。

图1 KOA与药物交集靶基因韦恩图

2.4 核心靶点筛选

使用STRING平台对89个交集基因进行PPI分析，去除游离节点。将输出的TSV文件导入Cytoscape软件，得出88个节点和1 665条边，用Network Analyzer插件计算出节点度值并进行调整，面积越大、色越深越重要，见图2。度值降序排序前10为核心靶点，见表2。

图2药物疾病交集靶点蛋白互作网络

表2核心靶点

2.5 GO、KEGG富集分析结果

DAVID分析结果中GO分析有629条：生物学进程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)分别有13、40、76条。根据Count值降序排序，且P<0.05分别筛选出前10的条目，使用微生信平台绘制气泡图，P值越小，颜色越深，越显著，点大小与基因数成正比，见图3。主要参与基因表达的调控，细胞增殖及凋亡的调节，炎症反应等生物学进程；主要在细胞质、细胞核、高分子复合物、外泌体等细胞组分发挥作用；主要参与蛋白质结合、DNA结合等分子功能。KEGG结果146条，根据Count值降序排序，且P<0.05,筛选出前20条目，使用微生信平台绘制气泡图，P值越小，颜色越深，越显著，点大小与基因数成正比，见图4。排除胰腺癌、肝炎、前列腺癌等不相关信号通路，保留KOA相关的PI3K-Akt、TNF、IL-17信号通路。

2.6 药物与疾病通路关系的网络构建及首要活性成分筛选结果

图3 GO分析结果

图4 KEGG分析结果

在Cytoscape软件构建上述网络调控图，见图5;用Network Analyzer插件计算每个节点度值，筛选药物活性成分，并根据度值降序排序，排在首位的活性成分为MOL000098(槲皮素)。

图5“药物-成分-靶基因-信号通路”网络

2.7 分子对接结果

用前5个核心靶点与MOL000098(槲皮素)做分子对接，采用AutoDock软件计算结合能，查看最低结合能构想。结合能小于-5 kcal/mol表明分子之间具有较强结合活性[10]10]。结果显示槲皮素与各靶点均有较强结合力，见表3。用PyMOL软件对最低结合能构象可视化，见图6。

表3分子对接最低结合能

图6槲皮素与核心靶点分子对接构象

3、讨论

对桑寄生-茯苓药对与KOA进行网络药理学分析，筛选出主要活性成分槲皮素和蛇床素。研究发现槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化活性[11]11],主要机制为抑制M1巨噬细胞极化，促进M2巨噬细胞极化改变关节内滑膜微环境，从而发挥抗炎、促进软骨保护及再生的作用[12]12]。蛇床素同样具有良好抗炎活性，可通过抑制相关炎性因子表达，从而有效减轻小鼠后爪的炎性水肿[13]13]。蛇床素通过促进软骨细胞生存的聚集聚糖和胶原蛋白II水平上调，抑制基质金属蛋白酶(MMP),保护细胞外基质(ECM),同时抑制软骨细胞凋亡来发挥抗KOA的作用[14]14]。

结果显示，核心靶点有TNF、IL6、VEGFA、TP53、IL1B、MMP9等。GO分析显示，桑寄生-茯苓药对主要通过对相关基因的表达、蛋白质生成以及细胞循环来发挥抗KOA作用。核心靶点中TNF、IL6、IL1B是骨关节炎中的关键促炎因子[15]15],可诱导活性氧和基质降解蛋白酶的表达[16]16],加速KOA进展。VEGFA可促进血管生成，相关研究表明，随着骨关节炎严重程度增加，血管对关节软骨侵犯越来越大，VEGFA表达也在增加[17]17],另一方面，VEGFA也是软骨成骨的关键步骤[18]18]。TP53可调节细胞修复以及凋亡[19]19]。基质金属蛋白酶MMP9在关节炎中表达增加，具有降解细胞基质的作用[20]20],可协同炎症因子破坏关节软骨。

KEGG结果分析桑寄生-茯苓药对在防治KOA中主要涉及PI3K-Akt、TNF、IL-17等信号通路。PI3K-Akt信号通路与炎症反应、细胞凋亡等方面密切相关[21]21]。有学者研究发现抑制PI3K/Akt通路，可下调大鼠KOA模型软骨中IL-6、IL-1β、TNF-α以及MMP9水平[22,23]22-23],抑制软骨细胞凋亡从而改善KOA大鼠关节功能。在缺血性以及炎性病变中，PI3K/Akt通路可调控大鼠血清中VEGF水平，调整局部血供[24]24]。PI3K/Akt通路介导TP53表达，影响细胞的生命周期，该类研究广泛在肿瘤领域开展[25]25]。低强度脉冲超声治疗通过抑制TNF通路，减少TNF-α分泌并促进关节软骨再生从而缓解KOA[26]26]。IL-17信号通路是KOA发病关键通路，抑制该通路下调血清中IL-17水平可以明显减少软骨外基质的降解和破坏[27]27]。

综上，桑寄生-茯苓药对关于KOA的防治是多靶点、多信号通路。本研究仅在客观分子水平，需要进一步结合国内外相关通路和靶点的研究，设计动物实验，获取相关实验数据，分析得出更直观的成果，为新药开发提供科学理论，为KOA患者提供更优的治疗方案。

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基金资助:湖南省中医药管理局一般项目(2021088);