膝骨关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）是临床常见疾病，以软骨退变、软骨下骨硬化、细胞外基质代谢失衡为主要病理表现[1]，临床表现为膝关节肿胀、疼痛、关节活动受限[2]。据报道，在我国40岁以上骨关节炎的患病率已达38.46%[3]，且随着人口老龄化，患病率有上升的趋势。

KOA的治疗有多种方法，西医以药物和手术治疗为主。非甾体类药物虽能起到止痛作用，但长期服用会有一定的副作用，手术治疗费用较昂贵[4]。针灸作为我国的传统医学，治疗KOA疗效显著，中国骨关节炎诊疗指南也推荐用针灸来治疗骨关节炎[5]。沉默信息调节因子同源蛋白1(Silent informationregulator 2 homolog protein 1,SIRT1）又称长寿基因，与衰老相关，在骨关节疾病中发挥重要的作用[6,7,8]。在软骨损伤中，SIRT1可以通过调节线粒体功能、细胞周期等促进软骨修复[9]，但具体机制还不明确。本研究通过电针干预KOA大鼠，探究电针对老龄大鼠膝骨关节炎及SIRT1的影响。

1、材料与方法

1.1 实验动物16

只24月龄SD雄性大鼠随机分为老年组和电针组，体质量为709±93g，每组8只；另取8只6月龄SD雄性大鼠为青年组，体质量为501±23g。大鼠由长沙天勤生物技术公司提供，合格证号CXK（湘）2019-0015，饲养于南华大学动物实验中心，室温、湿度、光照适宜，大鼠自由进食。实验方案经南华大学附属第一医院医学伦理委员会批准，批准号NO.202005110032。实验过程中，遵循实验动物管理条例等相关规定。

1.2 主要试剂及仪器

Ⅱ型胶原C端肽试剂盒（中国北京康为世纪，批号：C0681257875），显微-CT（广州中科恺盛医疗科技有限公司，型号：eX-plore Locus SP），台式冷冻离心机（中国湖南湘仪，型号：H1650R），荧光定量RCP仪（美国Therm，型号：PIKOREAL96）、电泳仪（中国北京六一，型号：DYY‐2C),mRNA逆转录试剂盒（北京康为世纪，批号：CW2141），华佗牌电针仪（苏州医疗用品有限公司，型号：SDZ‐V）、华佗牌一次性无菌针（0.25mm×25mm，苏州医疗用品有限公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：OLYMPUS CH-20）。

1.3 分组与造模

24月龄SD雄性大鼠16只，随机分为老年组和电针组各8只；另8只6月龄SD雄性大鼠为青年组。结合课题组前期研究[10,11,12]及国外类似研究[13,14,15]，本研究通过自然衰老方式复制骨关节炎动物模型。

1.4 干预方法

电针组接受电针干预，大鼠在苏醒状态下固定于鼠板，参照《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》[16]取穴双侧“太溪”“足三里”“阳陵泉”“血海”，针刺3～5mm，采用疏密波，密波15Hz，疏波3Hz，电流1mA,1次/天，每次30min，每周5天，连续干预8周，其余两组不做处理。

1.5 观察指标

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）进行麻醉。摘除眼球，眼眶取血，ELISA法检测外周血CTX-Ⅱ水平；切取左侧胫骨平台2cm左右标本，多聚甲醛固定，显微CT检测左膝软骨及软骨下骨骨微结构；番红-固绿染色观察左膝软骨及软骨下骨组织形态学结构；RT-qPCR、Western blot检测分别右膝软骨及软骨下骨mRNA、蛋白表达。

1.5.1 ELISA检测外周血CTX-Ⅱ

大鼠眼眶取血约4mL,4℃1000G，离心外周血15min，取上清，按ELISA试剂盒说明检测CTX-Ⅱ水平。

1.5.2 Micro-CT检测左胫骨微结构

左膝软骨及软骨下骨多聚甲醛浸润24h，冰箱保存。使用显微CT对左膝软骨下骨进行扫描，扫描参数设置：电流强度0.1mA，图像分辨率1024×1024，扫描时间4min，曝光时间8ms。将扫描后图片导入系统中，计算出各组大鼠骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁间距（Tb.Sp）等参数。

1.5.3番红-固绿染色

显微CT检测后，将左膝软骨及软骨下骨放入10%的甲醛EDTA螯合剂脱钙5周，石蜡浸润，切片，厚度约4μm，烘干切片脱蜡。将切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中10min,100%乙醇（I)中5 min洗去二甲苯；95%乙醇中水化5min,85%乙醇中水化5min，蒸馏水中水化待用。将切片番红染色1～2h，固绿染色5min左右，无水乙醇脱水5min，二甲苯透明5min，最后中性树胶封片，光学显微镜观察，收集图片并分析。

1.5.4 Mankin's评分

采用Mankin's评分量表[12]评估左膝软骨及软骨下骨组织形态结构，包括软骨结构、软骨细胞、基质染色、潮线完整性等四个方面，评分细则见表1。  

表1 Mankin's评分细则    

表2 引物信息  

1.5.5 RT-qPCR法检测aggrecanase-2、SIRT1mRNA表达水平

随机选取5只大鼠样本进行检测，取存于Trizol中右膝关节软骨组织约0.02g，充分研磨，常温下裂解5min，加入200μL三氯甲烷后，静置3min,4℃，12000r/min离心15min后加200μL的异丙醇，静置，4℃，12000r/min离心10min后，去上清。以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，检测右膝软骨及软骨下骨mRNA表达水平。运用primer5软件设计引物，由北京擎科合成引物，引物序列见表2。

1.5.6 Westernblot检测aggrecanase-2、SIRT1蛋白表达水平

随机选取5只大鼠样本进行检测，取0.025g右膝关节软骨组织，加入RIPA裂解液300μL反复研磨，12000rpm离心15min提取蛋白。配制10%的分离胶加入TEMED后灌胶。电泳，转膜，封闭，将一抗按比例稀释（aggrecanase-2 0.2～2μ/mL,β-actin 1:5000），孵育，稀释HRP标记的二抗（HRP goat antimouseIgG 1:5000），共同孵育，ECL发光液孵育1min，显影冲洗，用Image J 1.8.0软件进行分析，检测右膝软骨及软骨下骨aggrecanase-2、SIRT1蛋白表达水平。

1.6 统计方法

采用SPSS26.0软件进行数据分析。计量资料以均值加减标准差表示，多组间及治疗前后比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CTX-Ⅱ含量比较

与青年组相比，老年组外周血中CTX-Ⅱ含量增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与老年组大鼠相比，电针组大鼠外周血中CTX-Ⅱ水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 各组大鼠CTX-Ⅱ水平比较 

2.2 软骨下骨显微CT比较

青年组骨小梁结构正常，排列紧密；与青年组相比，老年组骨小梁结构异常，数量明显减少，排列稀疏，出现空腔；与老年组相比，电针组骨小梁数量有所增加，骨小梁间距减小空腔减小，见图1。

2.3 软骨下骨微结构比较

与青年组相比，老年组大鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数量减少，差异有统计学意义（P<0.05），骨小梁间距增大，差异有统计学意义（P<0.05）；与老年组相比，电针组骨密度增加，差异有统计学意义（P<0.05），骨小梁间距减少，差异有统计学意义（P<0.05），骨体积分数、骨小梁数量有增加的趋势，差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

2.4软骨组织番红-固绿染色比较

青年组软骨表面光滑平整，形态结构正常，基质染色均匀，潮线正常；老年组表面结构破坏严重，出现裂隙，染色不均，出现多重潮线；电针组软骨表面平整，未见明显裂层，染色较均匀，细胞结构介于其余两组之间，见图2。

图1 各组大鼠左膝关节软骨下骨显微CT比较    

表4 各组大鼠软骨下骨微结构比较 

图2 各组大鼠关节软骨组织番红-固绿染色比较（×200)   

2.5 Mankin's评分比较

与青年组相比，老年组Mankin's评分增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与老年组相比，电针组Mankin's评分降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

2.6 aggrecanase-2、SIRT1 mRNA表达比较

与青年组相比，老年组右膝关节软骨及软骨下骨aggrecanase-2 mRNA表达升高、SIRT1 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与老年组相比，电针组右膝关节软骨及软骨下骨aggrecanase-2 mRNA表达降低、SIRT1 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表6。

2.7 aggrecanase-2、SIRT1蛋白表达水平比较

与青年组相比，老年组右膝关节软骨及软骨下骨aggrecanase-2蛋白表达升高、SIRT1蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与老年组相比，电针组右膝关节软骨及软骨下骨aggrecanase-2蛋白表达降低、SIRT1蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05),见表7、图3。  

表5 各组大鼠Mankin's评分比较    

表6 各组大鼠aggrecanase-2、SIRT1 mRNA表达水平比较   

表7 各组大鼠aggrecanase-2、SIRT1的蛋白表达水平比较  

图3 各组大鼠aggrecanase-2、SIRT1蛋白表达水平比较   

3、讨论

膝骨关节炎属于“痹证”“骨痹”等范畴，按中医理论，肾主骨生髓，肝主筋。《素问·痿论篇》指出“骨枯而髓减，发为骨痿”，《灵枢·经脉》指出“足少阴气绝，则骨枯”。“太溪”为肾经原穴，主治肾虚证；“足三里”是足阳明胃经的主要穴位之一，有通经活络、扶正祛邪的作用；“阳陵泉”为筋之会穴，具有舒筋和壮筋的作用；“血海”是足太阴脾经上的重要穴位，有运化脾血之功，故选用以上穴位进行电针刺激。

针灸治疗KOA疗效确切。一项多中心研究显示[17]，电针对KOA患者持续干预8周，每周3次，发现电针可以使患者的疼痛减轻，膝关节功能得到改善，且随访显示疗效持续到26周。基础研究显示，电针可以缓解KOA大鼠关节软骨降解[12]，促进KOA大鼠关节软骨及软骨下骨由M1向M2[11]，抑制细胞凋亡[10]。

Mankin's评分是公认用来评估软骨退变的通用标准，总分14分，得分越高，软骨退变越严重。本研究中，老年组Mankin's评分为10.88±2.53分；番红-固绿染色显示，表面结构破坏严重，形态结构异常，出现裂隙，染色不均。结合Mankin's评分及番红-固绿染色结果，参考课题组前期研究结果[10,11,12]，可视为造模成功。

有研究报道，骨关节炎早期软骨下骨局部会形成骨质疏松，骨微结构会发生改变，表现为骨密度、骨体积分数减少[18,19]。孙光华等[20]研究表明，电针治疗可以提高去卵巢大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量，从而达到治疗骨质疏松的目的。还有研究发现[21]在OA动物模型中，软骨下骨骨小梁数量减少，骨体积和骨密度下降。在本研究中，电针干预后，大鼠骨密度增加，骨小梁间距减少，实验结果说明电针干预可以改善KOA大鼠的骨微结构，这与孙光华等研究结果一致。

KOA的发生由多种因素导致，与软骨细胞、细胞外基质的代谢失衡有关，因此临床上治疗KOA更注重对关节软骨的保护。关节软骨主要由胞外基质和软骨细胞组成，细胞外基质的代谢处于动态平衡中，代谢失衡时就会发生骨关节炎。细胞外基质主要由蛋白聚糖和Ⅱ型胶原构成，Ⅱ型胶原是三螺旋结构，可为关节软骨提供骨架支持，蛋白聚糖附在Ⅱ型胶原表面，对其起保护作用并提供抗压及润滑作用。蛋白聚糖酶是引起蛋白聚糖水解的主要酶之一，蛋白聚糖酶属于ADAMTS家族，其中蛋白聚糖酶-1(aggrecanase-1）和蛋白聚糖酶-2(aggrecanase-2）是主要的蛋白聚糖水解酶，是软骨降解的始动因素[22]。Ⅱ型胶原发生降解时，Ⅱ型胶原C端肽（CTX-Ⅱ）是其中的产物之一，因CTX-Ⅱ较稳定，且在肾中不能被降解，可以小肽形式进入血液，因此常检测血液中的CTX-Ⅱ含量来反映软骨代谢水平。在本研究中，老年组大鼠外周血中CTX-Ⅱ水平较青年组增加，骨组织中aggrecanase-2的mRNA及蛋白表达水平较青年组增加，说明老年组大鼠关节软骨发生了降解。电针干预后，电针组CTX-Ⅱ水平、aggrecanase-2的mRNA及蛋白表达水平均降低，说明电针干预能够抑制KOA大鼠关节软骨的降解。

SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的去乙酰化酶，位于染色10q22.1，全长为33660bp，编码747个氨基酸，包含9个外显子、8个内含子。SIRTl有脱乙酰基酶活性，因此有保护膝骨关节炎的作用。SIRT1在基因稳定、肿瘤的发生中起重要作用，与退行性骨关节疾病及衰老疾病密切相关。SIRT1还与软骨细胞增殖分化有关[23,24]，参与软骨缺损修复[25,26]。SIRT1可通过调节细胞自噬、促进Ⅱ型胶原的合成等形式延缓OA进展[27]，激活SIRT1的表达，可以发挥其去乙酰化酶作用，保护软骨细胞[28]。研究报道[29],OA患者成骨细胞SIRT1表达下降，敲出SIRT1的表达可抑制Ⅱ型胶原的产生。葡萄糖胺可提高SIRT1的mRNA及蛋白的表达，从而保护OA软骨[30]。在本研究中，老年组大鼠SIRT1 mRNA及蛋白表达降低，电针干预后SIRT1 mRNA及蛋白表达升高，说明电针干预能够促进SIRT1的表达。

本研究也还有存在不足的地方，例如电针参数尚无统一标准，参照的是既往研究，未研究不同参数对实验的影响，需要课题组进一步研究。

综上所述，电针可通过促进SIRT1的表达，抑制关节软骨降解，改善软骨下骨骨微结构，从而保护关节软骨。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81973917､82105022);湖南省自然科学基金(2021JJ40493､2021JJ30616､2023JJ40586);湖南省卫生健康委项目(20200464);南华大学校级重点项目(USCKF201902K02);

文章来源:黄夏荣,胡莉芝,王金玲,等.电针对KOA大鼠关节软骨及软骨下骨降解相关蛋白表达的影响[J].中医康复,2024,1(05):10-15.