宫颈癌(cervical cancer, CC)是全球常见的女性恶性肿瘤，也是20～39岁女性癌症死亡的第二大原因，每年全球有超过60万的女性被确诊为CC[1-2]。2020年我国女性CC的发病率和死亡率分别为18%和17%[3],CC严重危害女性健康，完善CC致病机制相关研究对于提升临床CC患者的生存率有重要意义。近年来，越来越多的证据表明细胞焦亡与CC之间存在密切关系，诱导肿瘤细胞焦亡是治疗CC的一种有效策略[4]。细胞焦亡的经典途径是通过半胱天冬酶1(caspase-1)识别Gasdermin D(GSDMD)的裂解介导的，近年来半胱天冬酶3(caspase-3)参与继发性细胞焦亡的过程引起关注，caspase-3可以识别Gasdermin E(GSDME)的裂解而诱导细胞焦亡发生[5]。这表明调控caspase-3/GSDME介导的肿瘤细胞焦亡可能是一种治疗CC的潜在有效策略。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类高度保守的非编码单链RNA,可附着于靶基因的3' UTR域导致mRNA降解， 从而在转录后水平抑制基因 表达[6]。miR-133a-5p作为miRNA的一员，是在多种肿瘤组织中低表达的抑癌基因[7]。已有研究发现miR-133a-5p在CC细胞中呈低表达[8],但其在CC中调控细胞焦亡的机制仍不清楚。我们在TargetScan数据库进行了miR-133a-5p的靶基因预测分析，发现miR-133a-5p与caspase-3具有潜在的结合调控作用。因此，本研究拟通过在Hela细胞中过表达miR-133a-5p,探究miR-133a-5p靶向caspase-3调控细胞焦亡影响宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。为CC的早期诊断、治疗及预后评估增添新的理论依据和实践基础。

1、材料与方法

1.1材料

人宫颈癌Hela细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，并经过STR鉴定正确。MEM培养基、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，人活性氧(reactive oxygen species, ROS)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒购自上海科顺生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。BCA蛋白浓度测定及SDS-PAGE凝胶试剂盒购自 北京索莱宝科技有限公司。GSDME(1∶1 000)、GSDME-NT(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)兔抗购自美国Abcam公司，山羊抗兔二抗GAPDH(1∶10 000)购自武汉三鹰生物技术有限公司。反转录试剂盒和Real-time PCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物公司。

1.2仪器

电泳和电转仪是美国Bio-Rad公司产品，实时定量PCR仪是美国Bio-Rad公司的CFX96产品，流式细胞仪是美国贝克曼库尔特公司产品。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养及转染

人宫颈癌Hela细胞在含有10%胎牛血清的MEM细胞培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2。正常Hela细胞作为空白对照组(Control组)。转染组前一天对细胞株进行传代，待其汇合度为30%～50%,分别将mimics-NC质粒和miR-133a-5p mimics质粒转染至Hela细胞，分别命名为NC-mimic组和miR-133a-5p mimic组，使用Lipofectamine 2000作为助转剂。

1.3.2 CCK-8法检测各组细胞增殖能力

取各组Hela细胞，胰酶消化后吹打细胞并计数，将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞，每孔细胞为1×104个。收集0 h、24 h、48 h、72 h、96 h时间点的细胞，加入10μL CCK-8检测液。孵育4 h后，使用酶标仪测定450 nm处的OD值。

1.3.3 Transwell小室检测各组细胞的迁移与侵袭情况

细胞迁移实验：各组Hela细胞消化后用无血清培养基重悬后接种于Transwell小室(美国Costar公司)的上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的MEM细胞培养基，培育24 h后收集小室并用磷酸盐缓冲液洗涤2次，4%多聚甲醛固定30 min后采用0.1%结晶紫染色30 min,最后用湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞并于镜下随机选取5个视野进行计数。

细胞侵袭实验：基质胶Matrigel(美国BD公司)与无血清培养基按1∶5的比例进行稀释并包被Transwell小室底部膜的上室面，取各组Hela细胞消化后按5×104个的数目接种于上室中，下室加入600μL含20%胎牛血清的MEM细胞培养基，孵育48 h后收集小室并用磷酸盐缓冲液洗涤2次，4%多聚甲醛固定30 min后采用0.1%结晶紫染色30 min,最后用湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞并于镜下随机选取5个视野进行计数。

1.3.4 ELISA检测ROS水平

收集各组Hela细胞上清液，按照ROS ELISA试剂盒说明书进行实验，使用酶标仪测定450 nm处各组细胞上清液的OD值，随后通过标准曲线计算样品中的ROS水平。

1.3.5流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组Hela细胞，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒进行细胞凋亡的检测。按照试剂盒说明书步骤，取0.5 mL细胞悬液，加入1.25μL Annexin V-FITC,用0.5 mL预冷的结合缓冲液重悬，加入10μL PI,随后通过流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.3.6蛋白质印迹法(Western Blot)检测蛋白表达水平

各组细胞使用RIPA法裂解，BCA法进行蛋白定量，经SDS-PAGE凝胶电泳分离，蛋白凝胶转移至PVDF膜，室温封闭1 h,孵育一抗caspase-3、cleaved caspase-3、GSDME、GSDME-NT,在4℃冰箱摇床上孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10 min,加入二抗稀释液室温孵育1 h,再次同样条件洗膜。加入化学荧光发光底物，曝光仪曝光，记录成像结果，用Image J软件分析条带灰度值。

1.3.7实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测mRNA表达水平

采用Trizol试剂盒提取各组Hela细胞中总RNA,酶标仪测定RNA浓度和计算OD260/OD280检测纯度。按照反转录试剂盒说明书操作得到cDNA,利用SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒扩增并检测miR-133a-5p mRNA、caspase-3 mRNA和GSDME mRNA。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.4统计学分析

应用GraphPad Prism 6进行统计分析及绘图，计量资料以

表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-133a-5p过表达细胞株构建

RT-qPCR实验结果显示，Control组和转染空载体的mimic-NC组中miR-133a-5p的表达没有明显差异，并且mimic-NC组miR-133a-5p的表达明显低于miR-133a-5p mimic组的表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明miR-133a-5p过表达细胞株构建成功，见图1。

2.2过表达miR-133a-5p对Hela细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，转染空载体的mimic-NC组细胞活性相较于Control组无显著变化，而miR-133a-5p mimic组细胞活性较mimic-NC组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明过表达miR-133a-5p能够抑制Hela细胞的增殖活性，见图2。

图1各组细胞中miR-133a-5p表达水平

图2过表达miR-133a-5p对Hela细胞增殖的影响

2.3 miR-133a-5p过表达对Hela细胞迁移及侵袭的影响

Control组和mimic-NC组的细胞迁移和细胞侵袭实验结果对比并没有明显差异，而miR-133a-5p mimic组的细胞数目与mimic-NC组对比明显降低(P<0.001),见图3。

图3过表达miR-133a-5p对Hela细胞迁移和侵袭的影响(结晶紫染色×200)

2.4过表达miR-133a-5p对各组细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，Control组、mimic-NC组和miR-133a-5p mimic组的凋亡率分别为(3.09±0.42)%、(2.54±1.72)%、(6.40±0.85)%。相比较于Control组和mimic-NC组的细胞凋亡率，过表达miR-133a-5p的细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义(P<0.05),见图4。

图4过表达miR-133a-5p对各组细胞凋亡的影响

2.5过表达miR-133a-5p对Hela细胞ROS水平的影响

ROS的ELISA检测结果显示，Control组、miR-133a-5p mimic组和mimic-NC组的ROS表达水平分别为(48.62±1.42)U/mL、(109.29±5.71)U/mL、(51.22±2.55)U/mL。Control组和mimic-NC组中ROS水平无统计学差异。miR-133a-5p mimic组ROS水平相较于mimic-NC组显著升高(P<0.000 1)。结果表明，过表达miR-133a-5p能够增加细胞中ROS的水平，见图5。

图5 miR-133a-5p过表达对各组Hela细胞内ROS水平的影响

2.6 miR-133a-5p过表达的靶向预测及对caspase-3和cleaved caspase-3表达的影响

为进一步寻找被其调控的潜在下游靶基因，本研究在TargetScan数据库(https: //www.targetscan.org/vert_80/)中对miR-133a-5p的靶基因进行了预测分析，miR-133a-5p与caspase-3有潜在结合位点(见图6A)。基于此，本研究预测caspase-3是miR-133a-5p的潜在靶基因。

Western Blot实验结果显示，过表达miR-133a-5p后能显著降低caspase-3的蛋白表达水平(P<0.01),并提升cleaved caspase-3蛋白的表达水平(P<0.05)(见图6B、图6C和图6D);RT-qPCR实验结果显示(见图6E),与Control组相比较，mimic-NC组中caspase-3 mRNA表达水平无明显差异，而miR-133a-5p mimic组caspase-3 mRNA表达水平显著低于mimic-NC组(P<0.000 1)。

图6过表达miR-133a-5p对细胞中caspase-3和cleaved caspase-3表达的影响

2.7 miR-133a-5p对GSDME和GSDME-NT表达的影响

Western Blot实验结果显示，与Control组相比，mimic-NC组中GSDME和GSDME-NT表达没有明显差异，而miR-133a-5p mimic组GSDME-NT蛋白表达水平较mimic-NC组显著升高(P<0.01),GSDME的蛋白表达水平则降低(P<0.001),见图7。

3、讨论

CC是最常见的女性恶性肿瘤之一，也是女性癌症相关死亡的重要原因[1]。无论CC的亚型和人乳头瘤病毒感染状况如何，CC患者的初级治疗通常包括手术、放化疗或这些治疗的组合[9]。随着医疗诊治技术的发展，虽然CC的发病率和死亡率在高收入国家已显著下降，但低收入国家CC患者的总体预后仍然很差[10]。全球每年仍有超过60万的确诊病例和34万的死亡病例[1]。尽管研究人员已经揭示了CC发生发展的部分分子机制，但仍然存 在大片空白。miRNA是一类内源性单链小分子RNA,具有调节细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和血管生成等生物学行为的功能[11-14]。近年来，大量研究证明miRNA作为基因表达调控网络中的重要一环参与CC的发生发展过程[14-16]。miR-133a-5p被证实在胃癌、前列腺癌、乳腺癌、CC等中表达下调[8,17-19]。LI等人[17]研究揭示了miR-133a通过下调酪氨酸激酶受体2及其下游p-ERK1/2和p-AKT的表达，进而抑制胃 癌细胞的增殖。KOJIMA等人[19]研究表明，miR-133a靶向前列腺癌细胞中嘌呤核苷磷酸化酶抑制细胞增殖、迁移和侵袭。CUI等人[18]研究显示，miR-133a通过EGFR/Akt信号通路抑制乳腺癌细胞的周期和增殖。YUAN等人[8]研究发现，NEAT1/miR-133a轴通过靶向作用SOX4,SOX4的异 常表达促进CC的发展。

本文探究了miR-133a-5p对人宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡及ROS水平的影响，结果发现过表达miR-133a-5p能够明显抑制Hela细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡水平，由此可知miR-133a-5p或在CC中扮演着重要角色，过表达miR-133a-5p对于抑制宫颈癌病情发展具有积极作用。随后，本研究在TargetScan数据库预测得到了miR-133a-5p的靶基因caspase-3,并利用RT-qPCR和Western Blot实验证实了过表达miR-133a-5p能够降低caspase-3的表达。结合过表达miR-133a-5p组细胞凋亡水平的增加，提示miR-133a-5p可能与调控肿瘤细胞的焦亡相关。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡过程，主要由细胞内炎症小体和Gasdermin蛋白家族介导，涉及多种炎症因子的释放[20]。细胞焦亡途径包括caspase-1依赖的经典途径和caspase-4/5/11依赖的非经典途径。两个细胞焦亡途径存在共同的执行蛋白GSDMD,其蛋白氨基端可被caspase-1/4/5/11剪切形成GSDMD-NT,进而破坏细胞膜触发细胞焦亡[21-22]。近年来，GSDME介导的细胞焦亡作为一种新的杀死肿瘤细胞的机制引起广泛关注，其主要通过caspase-3的切割作用将其转变为具有活性的GSDME-NT,参与多种肿瘤的发生发展及转归[5]。有研究发现[23],在Hela细胞中敲除GSDMD并用caspase-3切割位点补充时，Hela细胞可以从细胞凋亡转变为细胞焦亡。

图7过表达miR-133a-5p对GSDME和GSDME-NT蛋白表达的影响

为明确过表达miR-133a-5p对Hela细胞焦亡的影响，本研究首先检测了各组细胞中ROS的表达。已有不少研究指出ROS和肿瘤细胞焦亡之间存在密切关系[24],低剂量的ROS可刺激多种癌细胞增殖[25-26],并且ROS提升还可促发肿瘤细胞焦亡依赖性的表达[27]。本研究结果发现，过表达miR-133a-5p会上调ROS的表达，这提示过表达miR-133a-5p有可能促进Hela细胞焦亡的出现。随后本研究进一步检测了caspase-3和cleaved caspase-3以及细胞焦亡的关键蛋白GSDME,结果显示过表达miR-133a-5p可上调GSDME-NT和cleaved caspase-3的表达，降低caspase-3和GSDME的表达，提示相较于细胞凋亡，过表达miR-133a-5p对肿瘤细胞焦亡的促进作用更为显著。

然而本实验也存在一定的局限性：我们的研究是在体外细胞水平上进行的，没有进行体内实验，后期将通过构建CC动物模型，探究miR-133a-5p调控继发性细胞焦亡的体内机制。总之，miR-133a-5p或能够通过靶向调控caspase-3/GSDME通路诱导细胞焦亡，进而抑制Hela细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，对caspase-3/GSDME通路的干预有望为CC治疗提供一种新的途径。

基金资助:2024年度江西省卫生健康委科技计划项目(编号:202410755);

文章来源:胡萍,彭蔚,王文华.miR-133a-5p调控细胞焦亡抑制宫颈癌细胞增殖､迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2024,32(20):3840-3846.