宫颈癌是全球第四大女性恶性肿瘤,其病因与人乳头瘤病毒感染有关。目前,以手术为主、放化疗为辅的治疗手段对局部晚期患者的治疗效果并不理想,全球每年因宫颈癌死亡的人数高达25万以上[1,2]。传统中药中许多单体化合物具有一定的抗肿瘤作用,不仅可降低手术、放化疗所带来的副作用,还可控制瘤体大小,延长患者生存期,提高患者生存率[3]。因此,寻找高效低毒的抗宫颈癌中药成分对宫颈癌治疗具有重要意义。光甘草定是从中草药甘草中提取的一种多酚黄酮类化合物,除了具有抗氧化、抗炎和神经保护作用外,还可通过抑制肿瘤细胞增殖、转移和诱导细胞凋亡等在骨肉瘤、乳腺癌和黑色素瘤等中表现出较好的抗肿瘤作用[4,5,6]。早期研究[7]显示,光甘草定对宫颈癌Hela细胞有一定的毒性作用,但其抗宫颈癌作用如何并不完全清楚。因此,本研究通过设计体外细胞实验,观察光甘草定对Hela细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制,以揭示光甘草定抗宫颈癌作用。

1、材料与方法

1.1主要材料

光甘草定(纯度>98%,上海源叶生物科技公司),青霉素、链霉素、胰蛋白酶和胎牛血清(美国Gibco公司),0.1%结晶紫、细胞计数(CellCountingKit-8,CCK-8)检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒(碧云天生物公司),人宫颈癌细胞系Hela(上海艾研生物科技公司),Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloprotease,MMP-2)、生存素(Survivin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)抗体(美国Abcam公司),1640培养基(美国Hyclone公司),辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG二抗和二喹啉甲酸试剂盒(碧云天生物技术研究所),膜联蛋白V-FITC(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)双染细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪(美国BD公司)。恒温二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司),多功能酶标仪(美国BioTek公司),Transwell小室(孔径8mm,美国BDBiosciences公司),倒置显微镜(日本OLYPUS公司),凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2Hela细胞培养

采用1640培养基(添加有0.1mg/ml链霉素、100U/ml青霉素和10%胎牛血清)在37℃、湿度饱和的5%二氧化碳细胞培养箱中常规培养Hela细胞。待细胞铺满瓶底80%～90%时,加入0.25%胰蛋白酶消化,并以1∶3比例传代。选取长势良好的第3代以上的细胞进行实验。

1.3CCK-8法筛选光甘草定作用浓度

在96孔细胞板上接种对数生长期的Hela细胞106个/孔,在37℃、湿度饱和的5%二氧化碳细胞培养箱中常规培养。待细胞达80%汇合度时,弃培养液,加入终浓度为0、1、2.5、5、10和20μmol/L光甘草定,每个处理设3个平行孔。孵育24h后,弃培养液,并加入CCK-8试剂10μl/孔孵育4h。采用多功能酶标仪检测各处理组细胞在490nm处的光密度(opticaldensity,OD)值,并按照公式:细胞存活率(%)=(药物组OD/对照组OD)×100%计算细胞存活率。实验重复3次。

1.4Transwell小室检测

将经无血清培养基稀释后的基质胶平铺于Transwell小室中,并在37℃下静置至凝固。将对数生长期的Hela细胞以每孔105个接种至24孔板上后,置于37℃、湿度饱和的5%二氧化碳细胞培养箱中培养过夜。次日,加入终浓度为0、2.5和5μmol/L光甘草定(每组设3个复孔)孵育24h后,以0.25%胰蛋白酶消化收集各组细胞,以无血清培养基重悬细胞。在基质胶包被的Transwell小室的上室中加入200μl细胞悬液(含105个细胞)/孔,下室中加入含10%胎牛血清的培养基600μl。置于37℃、湿度饱和的5%二氧化碳细胞培养箱中培养24h后,将小室取出,并拭去上室中残留的细胞。经磷酸缓冲液洗涤后,以90%乙醇和0.1%结晶紫分别对上层底部细胞进行固定与染色。洗去染色液后,自然干燥。采用倒置显微镜随机选取3个视野观察并统计各组中的侵袭细胞数。

1.5流式细胞仪检测

将对数生长期的Hela细胞按照每孔105个细胞接种至12孔细胞板上,在37℃、湿度饱和的5%二氧化碳条件下孵育过夜后,加入终浓度为0、2.5和5μmol/L光甘草定,每组设3个复孔。孵育48h后,以0.25%胰蛋白酶消化收集各组细胞,参照细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒说明书步骤上流式细胞仪分别检测各组细胞凋亡率以及细胞周期变化。实验重复3次。

1.6免疫印迹法检测

收集0、2.5和5μmol/L光甘草定孵育48h后的Hela细胞,加入细胞裂解液提取各处理组细胞总蛋白。参照二喹啉甲酸试剂盒说明书检测总蛋白的浓度与纯度。将蛋白样品与等体积上样缓冲液混匀后,置于沸水浴中煮沸5min。将热变性后的蛋白样品以每孔80μg上样至10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后转至聚偏二氟乙烯。将膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液封闭处理2h后,转入一抗工作液(Wnt11∶200、β-catenin1∶500、CyclinD11∶1000、MMP-21∶800、Survivin1∶800和GAPDH1∶1000)中并在4℃下孵育过夜。次日,经辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG二抗(1∶5000)室温孵育2h后,滴加化学发光剂曝光显影后,以GAPDH为内参,采用凝胶成像系统扫描分析各组细胞中Wnt1、β-catenin、CyclinD1、MMP-2和Survivin蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.7统计学分析

实验数据以x¯±s形式表示,采用SPSS22.0进行统计学分析,多组间比较使用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK-q,两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1光甘草定对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

CCK-8实验检测结果(表1)显示,1、2.5、5、10和20μmol/L光甘草定处理组细胞存活率较对照(0μmol/L)组均明显降低(P<0.05),且呈现一定的浓度依赖性;同时,光甘草定对宫颈癌Hela细胞的半抑制浓度为4.56μmol/L。后期选取2.5和5μmol/L光甘草定进行实验。

表1不同浓度光甘草定处理24h后Hela细胞存活率的比较

注:与0μmol/L相比,*P<0.05。

Note:Comparedwith0μmol/L,*P<0.05.

2.2光甘草定对宫颈癌Hela细胞侵袭的影响

Transwell小室实验检测结果(图1和表2)显示,2.5和5μmol/L光甘草定处理组中侵袭细胞数逐渐减少,且与对照(0μmol/L)组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3光甘草定对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果(图2和表3)结果显示,与对照(0μmol/L)组相比,2.5和5μmol/L光甘草定处理组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),且5μmol/L光甘草定的促凋亡作用更为显著。

2.4光甘草定对宫颈癌Hela细胞细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果(表4)显示,与对照(0μmol/L)组相比,2.5和5μmol/L光甘草定处理后Hela细胞在G0/G1期百分比明显升高,而在S期和G2/M期的百分比明显降低(P<0.05),且随着光甘草定浓度的升高,细胞在不同时相的变化越明显。

图1Transwell检测各组细胞侵袭结果(结晶紫染色×200)

表2各组中侵袭细胞数的比较

注:与0μmol/L相比,*P<0.05。

Note:Comparedwith0μmol/L,*P<0.05.

2.5光甘草定对宫颈癌Hela细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响

免疫印迹法检测结果(图3和表5)显示,与对照(0μmol/L)组相比,2.5和5μmol/L光甘草定处理组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin以及下游靶蛋白CyclinD1、MMP-2和Survivin的表达水平均明显降低(P<0.05),且5μmol/L光甘草定的作用效果较2.5μmol/L更明显。

图2流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况

表3各组细胞凋亡率的比较

表4各组Hela细胞在不同时相下百分比的比较(%,x¯±s)

注:与0μmol/L相比,*P<0.05。

3、讨论

我国宫颈癌的发病率占女性恶性肿瘤的第七位,死亡率占第八位,且呈上升和年轻化趋势,严重威胁着女性的身体健康和生活质量[8];多数宫颈癌患者就诊时已为晚期,错失了手术根治性治疗的最佳时期,尽管放化疗在宫颈癌治疗方面取得了较为肯定的临床效果,但也存在着一些脱发、神经损伤和肾毒性等不良反应,极大地限制了其临床应用[9,10]。长期以来,中药廉价、低毒、高效等优势使其在肿瘤防治过程中占有重要地位,越来越多的中药提取物、中药单体成分和中药复方等被证实可通过抑制肿瘤细胞增殖转移、诱导细胞凋亡和逆转肿瘤多药耐药等发挥抗宫颈癌作用,在临床治疗中具有良好的应用价值[11]。因此,不断寻找新的、有效的中药抗宫颈癌成分对临床防治宫颈癌具有重要意义。

图3Westernblotting检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达

表5各组细胞中Wnt1、β-catenin、Survivin、MMP-2和CyclinD1蛋白表达水平的比较(x¯±s)

注:与0μmol/L相比,*P<0.05。

Note:Comparedwith0μmol/L,*P<0.05.

光甘草定是一种异黄酮,具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等广泛的药理活性[12]。随着中药抗肿瘤研究的不断深入,光甘草定抗肿瘤的作用越来越备受关注。ChenCT等[13]研究发现,光甘草定可通过JNK1/2途径诱导口腔癌细胞周期阻滞和凋亡,被认为是一种口腔癌治疗潜在的药物。YeX等[14]指出,光甘草定可通过调控miR-200c介导的上皮间质转化减弱乳腺癌细胞的迁移和侵袭,进而发挥抗乳腺癌转移的活性。TsaiYM等[15]研究指出,光甘草定可能是一种新的抗癌药物,可通过FAK/Rho信号通路抑制癌细胞的迁移、侵袭和血管生成等治疗肺癌。此外,光甘草定还在结直肠癌、胃癌和肝癌等肿瘤中表现出较好的抗肿瘤作用[16,17,18]。本研究以1、2.5、5、10和20μmol/L光甘草定处理后发现,宫颈癌Hela细胞存活率明显降低。该结果与ParkJH等[7]得到的光甘草定可抑制宫颈癌Hela细胞增殖活性的结果相吻合。根据光甘草定对宫颈癌Hela细胞的半抑制浓度,本研究以2.5和5μmol/L光甘草定进一步处理后发现,Hela细胞侵袭能力和细胞在S期、G2/M期的百分比均明显降低,而细胞凋亡能力以及细胞在G0/G1期百分比均明显升高。这提示光甘草定可通过抑制细胞增殖、侵袭并诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抗宫颈癌的作用,也在宫颈癌中进一步证实了光甘草定抗肿瘤的广谱性。

Wnt/β-catenin信号通路是细胞间信号传导的重要途径之一,Wnt1和β-catenin是该通路的关键因子,其异位表达可通过激活下游相关靶基因,增加细胞增殖能力、促进细胞上皮间质转化和转移等,在宫颈癌的发生发展过程中发挥着重要作用[19];CyclinD1是细胞周期的正向调控因子;MMP-2是基质金属蛋白酶家族成员,可通过降解细胞外基质,促进细胞侵袭和转移等;Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员,在调节细胞分裂和抑制细胞凋亡过程中发挥着重要作用;三者均是Wnt/β-catenin信号通路下游相关靶基因,受Wnt/β-catenin信号通路的调控[20,21]。为了探讨光甘草定抗宫颈癌的分子机制,本研究进一步检测发现,2.5和5μmol/L光甘草定可引起Wnt1、β-catenin、CyclinD1、MMP-2和Survivin蛋白表达下调。MuJ等[22]研究指出,光甘草定抗乳腺癌血管生成的分子机制与其通过上调miR-148a靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。结果表明,光甘草定可抑制Wnt/β-catenin信号通路活化。这提示,光甘草定抗宫颈癌的分子机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路活化有关。

综上所述,光甘草定可抑制宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭并促进其凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化有关。本研究仅从单种宫颈癌细胞系中证实了光甘草定的抗癌作用,后期将从多种细胞系和体内裸鼠实验进一步研究,以期为光甘草定抗宫颈癌的临床应用提供实验依据。

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基金:广西自然科学基金(编号:2010GXNSFA013260).