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低分子肝素对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响

2020-09-29 215 上传者：管理员

摘要：目的：研究低分子肝素(LMWH)对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响及其对微小RNA-409-3p(miR-409-3p)/核糖核苷酸还原酶调节亚基M2(RRM2)分子轴的调控作用。方法：体外培养宫颈癌细胞HCC94,实验分为对照组(正常培养细胞)和低、中、高剂量实验组(LMWH-L,LMWH-M,LMWH-H组,LMWH浓度为25,50,100U•mL-1)、miR-NC组(转染阴性对照)、miR-409-3p组(转染miR-409-3pmimics)、LMWH+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC,LMWH浓度为100U•mL-1)、LMWH+anti-miR-409-3p组(转染anti-miR-409-3p,LMWH浓度为100U•mL-1)。以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况;以流式细胞术检测细胞凋亡率;以实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Westernblot)分别检测miR-409-3p、RRM2的表达量;以双荧光素酶报告实验验证miR-409-3p与RRM2的靶向关系。结果：对照组、LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组细胞活力分别为(100.32±16.25)%,(75.36±11.26)%,(52.32±10.03)%,(33.21±6.59)%;细胞凋亡率分别为(8.65±1.26)%,(15.36±2.32)%,(26.54±2.19)%,(35.49±3.28)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-NC组与miR-409-3p组细胞活力分别为(100.25±20.30)%,(55.32±16.24)%;细胞凋亡率分别为(9.16±1.26)%,(25.64±5.27)%,差异有统计学意义(P<0.05)。LMWH+anti-miR-NC组与LMWH+anti-miR-409-3p组细胞活力分别为(35.21±7.52)%,(76.35±8.15)%;细胞凋亡率分别为(32.49±3.19)%,(12.32±2.16)%,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实miR-409-3p可靶向结合RRM2。结论：LMWH可通过调控miR-409-3p/RRM2分子轴从而抑制宫颈癌细胞增殖及诱导细胞凋亡。

关键词：
低分子肝素
凋亡
宫颈癌
核糖核苷酸还原酶调节亚基M2
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宫颈癌是临床常见的一种恶性肿瘤,化疗或放疗等是治疗宫颈癌的重要手段[1]。低分子肝素可抑制乳腺癌等肿瘤生长[2],微小RNA-409-3p(microRNA-409-3p,miR-409-3p)在宫颈癌中表达下调,并可能参与宫颈癌发生及发展过程[3]。核糖核苷酸还原酶调节亚基M2可能是miR-409-3p的靶基因。本研究旨在探讨LMWH对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响,及其对miR-409-3p/RRM2分子轴的调控作用。

材料与方法

1材料与试剂

细胞宫颈癌细胞HCC94,购自美国ATCC公司。

药品与试剂低分子肝素,规格:每支0.4mL/4000U,批号:1904171,国药准字:H20000705,天津红日药业股份有限公司生产;Lipofectamine2000,购自美国Invitrogen公司;miR-409-3p寡核苷酸模拟物(miR-409-3pmimics)及阴性对照mimicNC序列(miR-NC)、miR-409-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-409-3p)及阴性对照(anti-miR-NC),均购自广州锐博生物科技有限公司;噻唑蓝(methylthiazolyltetrazolium,MTT)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO),均购自美国Sigma公司;膜联蛋白V(AnnexinV)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;反转录与实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒,购自美国ThermoFisher公司;兔抗人RRM2抗体,购自上海群己生物科技有限公司;兔抗人增殖标记蛋白细胞增殖核抗原-67(Antigenidentifiedbymonoclonalantibody,Ki-67)、增殖细胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)抗体,均购自美国CST公司;兔抗人B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associatedXprotein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)抗体,均购自美国SantaCruz公司。

仪器FACSCantoⅡ流式细胞仪,购自美国BD公司;CFX384Touch荧光定量PCR仪,购自美国伯乐公司。

2方法

2.1实验分组与细胞培养[4]4]

HCC94细胞分为LMWH-L,LMWH-M,LMWH-H组(LMWH浓度为25,50,100U·mL-1)。同时将正常培养的细胞作为对照组。参照Lipofectamine2000试剂说明书分别将miR-NC、miR-409-3pmimics转染至HCC94细胞,分别记作miR-NC组、miR-409-3p组。分别将anti-miR-NC、anti-miR-409-3p转染至HCC94细胞,用100U·mL-1的LMWH处理24h,分别记作LMWH+anti-miR-NC组、LMWH+anti-miR-409-3p组。

2.2主要观察指标

2.2.1以MTT检测细胞增殖情况[5]5]

收集各组对数生长期HCC94细胞接种至96孔板(5×103个/孔),每孔加入MTT试剂20μL,继续培养4h,弃上清液,每孔加入DMSO150μL,用酶标仪检测各孔在波长为490nm处的光密度(OD)值。细胞活力(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

2.2.2以流式细胞术检测细胞凋亡率[6]6]

收集各组对数生长期HCC94细胞,预冷PBS清洗,4℃条件下以3000r·min-1离心6min,弃上清液,加入BindingBuffer悬浮细胞500μL,收集细胞沉淀,加入AnnexinV-FITC5μL与PI5μL,充分混匀,室温避光孵育10min,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.2.3以实时荧光定量聚合酶链反应(QuantitativeReal-timePCR,qRT-PCR)检测细胞中miR-409-3p、RRM2mRNA的表达水平[7]7]

收集各组HCC94细胞,用Trizol法提取HCC94细胞中的RNA,用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。参照反转录试剂盒说明书将RNA合成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应,参照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配置反应体系,反应条件:95℃2min,95℃30s,60℃30s,72℃30s,共40次循环,miR-409-3p以U6为内参,RRM2以GAPDH为内参,用2-ΔΔCt法计算miR-409-3p、RRM2mRNA相对表达量。

2.3次要观察指标

2.3.1双荧光素酶报告基因检测miR-409-3p的靶基因[8]8]

starBase预测显示RRM2的3′UTR含有miR-409-3p的互补序列,将含有结合位点与突变位点的序列插入荧光素酶报告基因载体分别构建野生型载体WT-RRM2、突变型载体MUT-RRM2,分别将miR-NC、miR-409-3pmimics与WT-RRM2、MUT-RRM2共转染至HCC94细胞,转染48h后收集细胞,检测相对荧光素酶活性。

2.3.2以蛋白质印迹(Westernblot)法检测RRM2、Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表达[9]9]

收集各组对数生长期HCC94细胞,加入RIPA裂解液400μL提取细胞总蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜,封闭,加入RRM2(稀释比1∶800)、Ki-67(稀释比1∶1000)、PCNA(稀释比1∶1000)、Bcl-2(稀释比1∶1000)、Bax(稀释比1∶1000)与内参GAPDH一抗稀释液,4℃孵育过夜,TBST洗涤,加入二抗稀释液(1∶5000),室温孵育1h,TBST洗涤,滴加ECL,用ImageJ软件分析各条带灰度值。

3统计学处理

用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料用表示,2组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析,组间多重比较用SNK-q法。

结果

1LMWH对HCC94细胞增殖的影响

与对照组比较,LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组细胞活力显著降低(均P<0.05),Ki-67、PCNA蛋白水平显著降低(均P<0.05),且LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组细胞活力、Ki-67、PCNA蛋白水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

2LMWH对HCC94细胞凋亡的影响

与对照组比较,LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组细胞凋亡率显著升高(均P<0.05),Bax蛋白水平显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05),且LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组间细胞凋亡率、Bax蛋白水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

3LMWH对HCC94细胞中miR-409-3p、RRM2mRNA表达量的影响

对照组、LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组miR-409-3p的表达量分别为1.02±0.13,2.16±0.11,3.20±0.12,4.28±0.15;RRM2mRNA的表达量分别为1.00±0.16,0.71±0.12,0.50±0.10,0.35±0.09。与对照组比较,LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组细胞中miR-409-3p的表达量显著升高(P<0.05),RRM2mRNA的表达量显著降低(P<0.05),且LMWH-L组、LMWH-M组、LMWH-H组miR-409-3p、RRM2mRNA表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1低分子肝素(LMWH)对HCC94细胞增殖的影响

表2LMWH对HCC94细胞凋亡和Bax表达的影响

4miR-409-3p过表达对HCC94细胞增殖及凋亡的影响

与miR-NC组比较,miR-409-3p组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白水平显著升高(P<0.05),见表3。

表3miR-409-3p过表达对HCC94细胞增殖及凋亡的影响

5miR-409-3p靶向调控RRM2

starBase预测显示miR-409-3p与RRM2存在结合位点,见图1。

双荧光素酶报告实验结果显示,共转染野生型载体WT-RRM2的细胞实验中,与miR-NC组(1.01±0.15)比较,miR-409-3p组(0.53±0.13)荧光素酶活性显著降低(P<0.05);共转染突变型载体MUT-RRM2的细胞实验中,miR-409-3p组(1.03±0.20)荧光素酶活性与miR-NC组(1.02±0.15)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组(0.85±0.13)比较,miR-409-3p组(0.42±0.11)RRM2蛋白水平显著降低(P<0.05);与anti-miR-NC组(0.86±0.18)比较,anti-miR-409-3p组(1.08±0.12)RRM2蛋白水平显著升高(P<0.05)。

6干扰miR-409-3p可减弱LMWH对HCC94细胞增殖及凋亡的作用

与LMWH+anti-miR-NC组比较,LMWH+anti-miR-409-3p组细胞活力显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05),RRM2、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05),Bax蛋白水平显著降低(P<0.05),见表4。

表4干扰miR-409-3p可减弱LMWH对HCC94细胞增殖及凋亡的作用

讨论

LMWH可抑制皮肤鳞状细胞癌增殖及迁移[10]。LMWH可抑制乳腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡。本研究结果显示。不同剂量的LMWH处理后可显著抑制宫颈癌细胞增殖,且呈剂量依赖效应,提示LMWH可减弱宫颈癌细胞增殖能力。本研究结果显示,不同剂量的LMWH处理后宫颈癌细胞中Ki-67、PCNA表达下调,提示LMWH可能通过调控Ki-67、PCNA的表达从而抑制宫颈癌细胞增殖。本研究结果显示,不同剂量的LMWH处理后宫颈癌细胞凋亡率显著升高,Bax表达上调,Bcl-2表达下调,提示LMWH可促进宫颈癌细胞凋亡,且呈剂量依赖性。

本研究结果显示,不同剂量的LMWH处理后宫颈癌细胞中miR-409-3p的表达量显著升高,提示LMWH可能通过调控miR-409-3p的表达从而影响宫颈癌细胞增殖及凋亡。本研究进一步分析显示miR-409-3p过表达细胞活力显著降低,细胞凋亡率升高,Ki-67、PCNA、Bcl-2表达下调,Bax表达上调,本研究通过双荧光素酶报告实验与Westernblot实验证实miR-409-3p可靶向结合RRM2,并可负向调控RRM2的表达及活性,提示LMWH可能通过调控miR-409-3p/RRM2分子轴从而影响宫颈癌细胞增殖及凋亡。本研究将anti-miR-409-3p转染至宫颈癌细胞,使用LMWH处理,结果显示细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低,RRM2、Ki-67、PCNA、Bcl-2表达上调,Bax表达下调,提示LMWH可通过上调miR-409-3p表达而下调RRM2表达从而抑制宫颈癌细胞增殖及促进细胞凋亡。

LMWH可抑制宫颈癌细胞增殖及诱导细胞凋亡,其作用机制可能与调控miR-409-3p/RRM2分子轴有关。

参考文献：

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