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高危型人乳头瘤病毒的研究进展

2020-12-14 161 上传者：管理员

关键词：
HPV
人乳头状瘤病毒
宫颈癌
恶性肿瘤
致病机制
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宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，而宫颈癌组织中人乳头瘤病毒（HPV）检出率高达99%，因此HPV感染被认为是宫颈癌和子宫颈上皮内瘤变（CIN）的必要条件。HPV具有多种不同亚型，其中高危型HPV感染致病的概率显著高于低危型HPV，高危型HPV的具体致病机制十分复杂。近年来发现了多种新的致病机制和影响因素，为HPV相关宫颈疾病的早期筛查、预防和新药研发提供了新思路，本文就高危型HPV的致病机制、检测方法、预防与治疗等方面研究进展作一综述。

1、HPV概述

HPV是一类小型、无包膜、环状、双链DNA病毒，是宫颈癌和CIN的重要致病因素。HPV亚型较多，根据致病力的高低分为高危型和低危型，低危型包括HPV-1、2、3、4、6、7、10、11、13、32、34、40、42、43等，高危型包括HPV-16、18、31、33、35、39、52、58、59等[1]。HPV感染可导致患者宫颈病变，多表现为阴道分泌物增多、阴道不规则出血、宫颈糜烂和下腹部疼痛等临床症状[2]。HPV主要通过性传播[3]，男性患者生殖器感染率虽高于女性，但病毒持续存在的可能性小，因此通常不会致癌，而女性患者因宫颈和阴道的结构有利于病毒的生存，是主要受害者，宫颈癌在妇科癌症中排名第四；超过2/3的患者来自于南非和拉丁美洲等欠发达地区，并成为该地区癌症死亡的主要原因[4]。高危型HPV-16、18在宫颈病变患者中检出率最高[5]，约占HPV所有亚型的71%，研究高危型HPV的致病机制、检测方法和预防方法等对于宫颈癌的早期筛查和治疗具有重要意义。

2、HPV引发宫颈癌的致病机制

HPV有3个基因功能区：早期区、晚期区和上游调控区，其中早期区编码早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7，参与调节病毒的生命周期、调控DNA复制、转录和病毒蛋白的翻译等[6]；晚期区编码晚期蛋白L1和L2，即病毒的衣壳蛋白，主要参与细胞表面吸附、病毒颗粒包装及病毒进入细胞质过程；上游调控区含有顺式调控单元及病毒复制的起点，负责调控病毒基因的复制和转录。

2.1E2参与调节HPV的转录

E2蛋白在HPV的转录过程中发挥着不同的调节作用，主要体现在病毒感染的时期。在与宿主基因组整合前，病毒仅处于潜伏期，E2蛋白可与靶位点E2BSs结合，通过特异性蛋白1(Sp1）和TATA结合蛋白（TBP）的移位抑制病毒转录。有研究表明，在导入了E2基因的宫颈癌细胞SiHa中，癌细胞的增殖明显下降，凋亡率明显上升[7]；而在与宿主基因组整合后，病毒进入了活跃期，E2基因被甲基化促进了HPV的转录、增殖[8]。

2.2E5维持HPV持续感染并介导免疫逃逸

在高危型HPV基因组与宿主整合后，宫颈复层鳞状上皮基底细胞内的E5蛋白会上调受体酪氨酸激酶（Met）的表达，以维持病毒的生命周期、复制和转录过程[9]。面对外源DNA的入侵，宫颈上皮细胞可在基底层分裂后凋亡、脱离，这种方式有利于机体降低病毒DNA的数量[10]，然而E5蛋白可通过激活表皮生长因子受体（EGFR），一方面延缓基底细胞的分裂和分化进程，另一方面上调环氧合酶-2的表达，刺激促凋亡相关基因Bax的降解作用，从而达到持续感染上皮细胞的目的[11]。此外，E5蛋白还可与V-型ATP酶质子泵的亚基相互作用，延缓了EGFR的降解，也有助于维持细胞内病毒的持续感染[12]。在宫颈癌发病初期，宿主会产生大量CD8+T细胞，CD8+T细胞通过识别肿瘤细胞表面主要的组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHC-Ⅰ）直接杀死肿瘤细胞，而E5蛋白的疏水区能与MHC-Ⅰ类分子重链相互作用，抑制MHC-Ⅰ的抗原提呈作用，尽量减少免疫应答发生的可能，维持被HPV感染肿瘤细胞的持续存在[13]。肿瘤细胞这种逃避免疫应答的机制使HPV更容易在体内定植，使宿主的抗病毒能力下降，从而有助于HPV持续感染状态的维持。

2.3HPVE6、E7是关键的致癌基因

低危型和高危型HPV的致病力差异主要体现在HPVE6、E7蛋白，低危型HPVE6、E7蛋白仅存在于被感染细胞的胞质，并不能诱导恶性转化[14]。而高危型HPVE6、E7蛋白可以进入宿主细胞核，是维持HPV阳性癌细胞恶性表型的关键因素，与细胞转化和永生密切相关。研究表明HPVE6基因表达产物可结合并诱导p53基因降解，以阻止肿瘤细胞凋亡，此外，高危型HPVE6蛋白的羧基端存在PDZ结合模序（PBM），其与PDZ蛋白的相互作用，促进病毒DNA进入细胞内，继而引发感染[15];HPVE7的基因表达产物以肿瘤抑制基因pRb为靶点并与之结合，能促进肿瘤细胞进入S期，从而得以永生。HPVE6、E7蛋白促进宫颈癌发生的其他机制如下。（1)HPVE6、E7蛋白通过内源性调控分子miRNA参与肿瘤的发病进程，例如，HPVE6、E7蛋白能特异性上调miR-146b-3p，从而抑制15羟基-前列腺素脱氢酶的作用，发挥了促进宫颈癌细胞增殖和迁移的作用，从而导致癌变的发生[16];HPVE6蛋白可以使miRNA-20a的表达增加，从而使细胞程序性死亡蛋白6上调，促进宫颈癌细胞的增殖[17];HPVE7蛋白能与pRB结合，导致宫颈上皮miR-182表达上调[18]，导致被感染细胞癌变。（2)HPVE6、E7蛋白通过长链非编码RNA(lncRNA）参与肿瘤的发病进程，HPVE6、E7蛋白通过转录因子c-Myc增加lncRNASNHG12的水平，促进E-钙黏着蛋白转录抑制因子Slug的表达，从而降低组织内细胞黏附强度，促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）能力[19]，而lncRNATMPOP2的异位表达也可上调HPVE6、E7基因，维持宿主体内宫颈癌细胞的存在[20]。另有研究发现了一类新的lncRNA———lnc-CCDST，具有抑制宫颈癌细胞运动和血管生成的功能，而HPVE6、E7蛋白能降低lncCCDST的表达，促进宫颈癌的进一步发展[21]。（3)HPVE6、E7蛋白通过影响信号通路参与肿瘤的发病进程，Toll样受体（TLR）是参与人类非特异性免疫的识别受体，广泛表达于人类恶性肿瘤组织中，HPVE6蛋白能与TLR-2、3、7、8、9等相互作用，破坏免疫反应，从而促进HPV致癌[22]。研究表明，高危型HPVE6、E6*蛋白能介导T细胞因子4(TCF-4）的转录因子与β-catenin结合，促进癌细胞增殖，并诱导TCF-4的稳定化，上调Wnt/β-catenin信号通路，有助于维持癌细胞的转化和永生化[23]。此外，HPVE6蛋白可通过促进calcineurin-NFAT2信号通路的表达，从而促进宫颈癌的进展[24]。（4)HPVE6、E7蛋白通过其他途径影响肿瘤的发病进程，例如HPVE6、E7基因可增加白细胞介素-6在宫颈癌细胞中的表达，造成长时间持续的炎症和高度增殖的微环境，从而有利于肿瘤发生[25]。同时，HPVE6、E7蛋白还可上调pirin基因表达以促进EMT，对宫颈癌的发展起着重要作用[26]。

3、高危型HPV的实验室检测方法

3.1传统检测方法

高危型HPV的检测对于宫颈癌的筛查、预防和治疗具有重要意义，其传统检测方法主要基于细胞学，如宫颈涂片和液基细胞学等，传统检测方法的特异度较高，但灵敏度不够高；使用针对病毒L1蛋白的单克隆抗体也可检测子宫脱落细胞中的HPV，方法简便、经济、易操作，但仅能判断患者是否感染HPV，适用于普查[27]。

3.2基于DNA的检测方法

HPVDNA检测的基本原理是针对HPV基因组特定序列设计引物和/或探针，对病毒进行定性或定量检测，相对于传统检测方法，其灵敏度和特异度较高，可实现HPV分型，但检出HPVDNA仅能说明病毒存在，并不代表发生了宫颈病变。近年来，新的检测方法不断出现，且取得了明显进展，但仍各有利弊，例如芯片杂交技术通过酶标HPV靶基因序列，与固相支持物上的探针分子进行杂交、显色，具有通量高、速度快的特点，一次性可实现多种HPV亚型分析，但该方法操作复杂，且容易造成交叉污染。AdvanSure和双巢式PCR是基于PCR进行改良方法，通过多重引物的设计实现了多重HPV亚型的检测[28,29]，该方法具有较高的灵敏度，但检测过程中易发生污染。第二代杂交捕获技术（HC2）通过放大抗体捕获的信号实现靶标检测，此方法无需经过PCR扩增就能实现13种高危型HPV的半定量检测，操作简便、特异度高，有效避免了分子扩增过程中可能出现的污染，但该方法检测灵敏度较低，且不能区分多重感染。酶切信号放大技术利用特异性酶识别并切割病毒DNA分子，通过分子杂交和化学信号放大直接检测特定DNA序列，此方法不会造成扩增时可能引起的交叉污染，对样本体积需求量小，可避免因样本量不足引起的假阴性，但能够检测的HPV亚型有限。数字PCR技术也被称为“第三代PCR”，无需标准曲线就能实现分子靶标的绝对定量检测，检测灵敏度高，定量准确，但其检测通量低，检测成本高，操作复杂，目前难以在临床广泛应用。尽管HPVDNA的检测技术在不断更新优化，但仍难以区分HPV的一过性感染和癌前病变，因此阳性检测结果可能会导致不必要的临床治疗。

3.3基于RNA的检测方法

在病毒感染的过程中HPVE6、E7基因会大量表达mRNA，从而产生大量致癌蛋白，使宫颈细胞逐渐发生癌变，因此病毒mR-NA检测是一种新的方式。Aptima逆转录扩增法利用转录介导的扩增技术（TMA）检测HPVE6、E7mRNA[30]，是目前唯一一个被美国食品及药物管理局（FDA）批准用于检测HPVmRNA的技术，HPVE6、E7mRNA的检出意味着病毒处于活跃期，与宫颈癌的关系更为密切，能有效减少对一过性HPV的检出，从而减少受检妇女不必要的阴道镜转诊和不必要的心理压力。最新的研究表明，采用荧光原位杂交技术检测宫颈脱落细胞中SurvivinmRNA的表达同样可用于宫颈病变筛查，提高了高度CIN和宫颈癌诊断的准确性和可预测性[31]。宫颈癌筛查的最佳策略是实现益处最大化和危害最小化，发现那些有可能发展为癌症的宫颈癌前病变，同时避免对一过性HPV感染导致的良性病变的检测和过度治疗，因此与传统DNA检测相比，检测HPVE6、E7mRNA不但灵敏度高，而且特异度更高，但因mRNA易发生降解，对样本质量的要求也更高。

4、高危型HPV的预防与治疗

控制宫颈癌的发病率可通过两种方式实现，一是预防癌前病变，二是尽早发现并治疗癌前病变，以遏止其发展为癌症。预防性疫苗是预防宫颈癌最有效的方法[32]。基本原理是将HPV的衣壳蛋白和病毒样颗粒注射入人体，通过抗原表位的特异性刺激机体产生相应的抗体以预防病毒侵袭，目前有3种HPV疫苗，根据可预防的亚型种类分为二价苗、四价苗和九价苗，其中以二价苗的免疫效价最高[33]，青少年因性器官发育尚未成熟，免疫功能低下，所以是重点接种人群，及早接种预防性HPV疫苗能有效防治HPV的持续性感染并降低宫颈癌的发病率。治疗性疫苗针对的靶抗原是HPVE6、E7蛋白，通过重新激发特异性T细胞介导的免疫反应，以清除被病毒感染或已变异的细胞，根据载体不同，HPV治疗性疫苗分为DNA疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、树突状细胞疫苗等[34]。除病毒载量和病毒类型之外，衣原体感染、长期吸烟、多胎生育和长期使用激素类避孕药也是增加宫颈癌风险的相关因素。加强生活习惯方面的认知，早期筛查、疫苗和药物的介入有助于降低宫颈癌的发病率和病死率。

保妇康栓是一类中药制剂，其中含有冰片与莪术油，不仅具有抗单纯游离病毒的感染作用，而且能够抑制宿主细胞染色体上的病毒基因片段并促进巨噬细胞吞噬病毒的能力。重组人干扰素α-2a是一类广谱抗病毒药物，与病灶细胞表面的受体相结合后可抑制病毒蛋白的合成并促进淋巴细胞、吞噬细胞和自然杀伤细胞吞噬被病毒感染的细胞。理解了HPV基因组致病蛋白有助于研制出有效的治疗药物，为临床治疗宫颈癌提供新的思路，例如miR-221可通过SOCS1/TypeⅠIFN信号通路抑制HPVDNA的复制[35]。EGFR抑制剂可控制癌前病变中的E5活性[10]；抑制靶向致瘤lncRNASNHG12和TMPOP2的表达或促进lnc-CCDST的表达可改变HPVE6、E7蛋白的活性[19,20,21]，这些成果都有可能成为潜在的治疗靶点。

5、展望

HPV对于宫颈癌及CIN的高致病性严重影响了女性的健康生活，并带来了严重后果，养成良好的生活习惯，提前预防、早发现、早治疗是改善预后的有效措施。虽然近些年来人们对于HPV致病机制的研究已经有了诸多的突破，但仍有许多机制有待于去探索，任重而道远。

参考文献：

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