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蛋白表达水平的变化与宫颈鳞癌患者临床特征

2021-03-05 113 上传者：管理员

摘要：目的:探讨叉头转录因子(Foxm1)蛋白、人血管生成素样蛋白(ANGPTL4)、蛋白激酶2β(CK2β)表达水平的变化与宫颈鳞癌发生、发展的相关性。方法:选取2011年01月至2015年01月本院妇科收集的宫颈鳞癌组织标本240例及正常宫颈组织标本80例为研究对象,分别作为宫颈鳞癌组和对照组。采用免疫组织化学SP法检测Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达情况,分析两组Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达差异,及三者与宫颈鳞癌临床特征和预后的关系。结果:宫颈癌组Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达阳性率及三者共同阳性表达率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);Foxm1蛋白阳性表达与肌层浸润、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05),ANGPTL4蛋白阳性表达与脉管浸润明显相关(P<0.05),CK2β蛋白阳性表达与FIGO分期、分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05);三者共同阳性表达者5年生存率低于单独的Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白阳性表达者。Foxm1、CK2β阳性表达与阴性表达的KaplanMeier生存曲线有明显差异(P<0.05);Foxm1阳性表达、CK2β阳性表达是影响宫颈鳞癌患者预后的独立危险因素。结论:Foxm1、ANGPTL4和CK2β蛋白在宫颈鳞癌组织中均表达上调，其中Foxm1和CK2β蛋白阳性表达可明显影响患者预后，且Foxm1、ANGPTL4和CK2β蛋白在促进宫颈鳞癌发生方面可能存在协同作用。

关键词：
人血管生成素样蛋白
叉头转录因子
宫颈鳞癌
蛋白激酶
预后
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宫颈癌是临床常见的恶性肿瘤之一,我国每年新发病例约为13万,每年死亡病例约5.3万,约占女性恶性肿瘤死亡的1/5,对女性身心健康造成严重影响[1]。宫颈癌发生率受环境改变和性传播疾病的影响,具有逐年上升倾向,同时具有年轻化趋势,所以早期诊断治疗以降低死亡率意义重大[2]。叉头转录因子(forktranscriptionfactor,Foxm1)蛋白与细胞增殖密切相关,可能作为调控因子参与多种肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤发生[3]。人血管生成素样蛋白(angiopoietin-like4,ANGPTL4)属于ANGPTL家族成员,是一种糖基化脂肪细胞因子,可参与肿瘤细胞生长、促进新生血管形成等过程[4]。蛋白激酶2β(proteinkinaseCK2β,CK2β)可通过细胞信号通路调节,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤增殖,在许多恶性肿瘤组织中表达明显升高[5]。目前关于Foxm1、ANGPTL4和CK2β表达水平变化在宫颈鳞癌病情发生、发展方面研究较多,但在预后方面的分析不足,为了进一步探讨Foxm1、ANGPTL4和CK2β表达水平对宫颈鳞癌的影响,本研究选取240例宫颈鳞癌组织标本,分析Foxm1、ANGPTL4和CK2β蛋白表达与宫颈鳞癌临床特征及预后的关系,以期为宫颈鳞癌诊治提供理论依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2011年01月至2015年01月本院妇科收集的宫颈鳞癌组织标本240例及正常宫颈组织标本80例为研究对象,分别作为宫颈鳞癌组和对照组。宫颈鳞癌组患者术前均未接受免疫治疗或放化疗,术后病理学检查确诊为宫颈鳞癌。宫颈鳞癌组年龄32～68岁,平均(54.11±8.71)岁;国际妇产科联盟(InternationalFederationofGynecologyandObstetrics,FIGO)分期:Ⅰ期61例、Ⅱ期85例、Ⅲ期94例;分化程度:高分化92例、中分化88例、低分化60例;淋巴结转移39例。对照组年龄35～70岁,平均(55.81±8.99)岁。两组年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。患者对本研究均知情。组织标本的获取和使用均获得本院伦理委员会批准同意。

1.2主要试剂

鼠抗人Foxm1单克隆抗体、兔抗人ANGPTL4多克隆抗体、兔抗人CK2β多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3免疫组织化学方法

采用免疫组织化学SP法检测Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达情况。根据SP试剂盒说明书步骤进行操作。一抗替换为鳞酸盐缓冲液作为阴性对照,预实验阳性片作为阳性对照。

结果判定:Foxm1阳性着色于细胞质和细胞核,ANGPTL4阳性着色于细胞质,CK2β阳性着色于细胞核,呈棕黄色颗粒。在镜下随机选取5个视野,根据阳性细胞所占比例评分,无阳性细胞记0分;阳性细胞0%～10%,计1分;阳性细胞11%～50%,计2分;阳性细胞51%～75%,计3分;阳性细胞75%～100%,计4分。根据染色强度评分,无色计0分,淡黄色记1分,棕黄色计2分,棕褐色计3分。两项评分乘积在3分以上者为阳性。

1.4随访

采用电话方式进行随访,随访截止日期为2019年01月30日,随访3～76个月,中位随访时间为46个月,统计总生存时间。

1.5统计分析方法

数据均采用SPSS21.0软件进行分析。宫颈鳞癌组及对照组Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达阳性率比较,宫颈鳞癌组织Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达与临床病理参数间的关系行卡方检验或连续校正卡方检验。生存分析采用KaplanMeier分析,组间比较采用Log-rank检验。预后影响因素分析采用COX比例风险回归模型。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达情况比较

宫颈鳞癌组Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1和图1。

表1两组Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达阳性率

图1宫颈鳞癌组织中Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白免疫组化图

2.2Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达与宫颈鳞癌临床特征关系

Foxm1蛋白阳性表达与肌层浸润、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05),ANGPTL4蛋白阳性表达与脉管浸润明显相关(P<0.05),CK2β蛋白阳性表达与FIGO分期、分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05),见表2。

表2Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达与宫颈鳞癌临床特征关系

2.3Foxm1、ANGPTL4、CK2β蛋白表达与宫颈鳞癌预后的相关性

Foxm1阴性表达者5年生存率为68.42%(39/57),Foxm1阳性表达者5年生存率为16.39%(30/183)。ANGPTL4阴性表达者5年生存率为56.52%(39/69),ANGPTL4阳性表达者5年生存率为38.60%(66/171)。CK2β阴性表达者5年生存率为65.52%(57/87),CK2β阳性表达者5年生存率为19.61%(30/153)。三者同时阳性表达者5年生存率为13.59%(14/103)。KaplanMeier生存曲线见图2-4。Foxm1、CK2β阳性表达者与阴性表达者的KaplanMeier生存曲线有明显差异(P<0.05)。

2.4宫颈鳞癌预后的COX单因素与多因素分析

经单因素分析,肌层浸润、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、Foxm1阳性表达、CK2β阳性表达、Foxm1+ANGPTL+CK2β共同阳性表达与宫颈鳞癌预后相关。多因素COX回归模型校正了年龄、肌层浸润、脉管浸润、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、Foxm1阳性表达、ANGPTL4阳性表达、CK2β阳性表达、Foxm1+ANGPTL+CK2β共同阳性表达等因素后,显示FIGO分期、分化程度、淋巴结转移、Foxm1阳性表达、CK2β阳性表达及Foxm1+ANGPTL+CK2β共同阳性表达是影响宫颈鳞癌预后的独立危险因素,见表3。

图2不同Foxm1蛋白表达水平患者生存曲线

图3不同ANGPTL4蛋白表达水平患者生存曲线

3、讨论

人乳头瘤病毒感染、过早的性生活、多次分娩等均是促进宫颈癌发生的重要因素之一[6]。长期随访研究显示,经手术治疗及辅助化疗,宫颈癌病死率及中位生存时间无明显改善[7],传统手术及放化疗在宫颈癌治疗方面具有局限性。随着免疫学及分子生物学的发展,生物学治疗或免疫靶向治疗在恶性肿瘤治疗上越来越受重视,而宫颈癌分子机制的研究不仅能为免疫靶向治疗提供新靶点,还能提供血清学指标。

Foxm1蛋白结构包含多个丝氨酸结构和糖蛋白结合配体,可将体内氧化应激性蛋白酶激活而改变肿瘤微环境,引起肿瘤细胞持续增殖。肿瘤细胞内Foxm1蛋白过度富集,可使p53、p16等基因转录活性增强,肿瘤相关蛋白翻译过度,对细胞周期非依赖性蛋白激酶活性造成影响,肿瘤细胞中G0期细胞比例显著降低,G1/S期比例显著升高[8,9]。杨建敏等[10]研究认为高表达的Foxm1可能参与宫颈癌的发生,并与宫颈癌病理分级密切相关,但并未针对Foxm1蛋白表达与临床预后关系进行研究。

图4不同CK2β蛋白表达水平患者生存曲线

本研究经免疫组织化学实验发现,与正常宫颈上皮组织比较,宫颈鳞癌组织中Foxm1蛋白阳性表达率明显较高,说明Foxm1蛋白与宫颈鳞癌发生有关,推测Foxm1能影响癌细胞基因调控,促进癌细胞增殖,抑制癌细胞凋亡等。在Foxm1表达与宫颈鳞癌临床特征关系研究中发现,Foxm1蛋白阳性表达与肌层浸润、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移明显相关,提示Foxm1蛋白对宫颈鳞癌病情具有促进作用,考虑与Foxm1蛋白影响癌细胞分化成熟诱导因子表达,促进宫颈癌旁组织、基底膜组织浸润有关。本研究未发现Foxm1蛋白与脉管浸润相关,排除纳入研究样本量不足问题外,考虑可能与Foxm1蛋白未明显增强癌细胞黏附能力有关。在Foxm1蛋白与预后关系分析中发现,Foxm1蛋白阳性表达者预后较差,且Foxm1蛋白阳性表达是影响预后的危险因素,因此临床上可将Foxm1蛋白表达情况作为评估宫颈鳞癌远期生存的参考指标。

表3宫颈鳞癌预后的COX单因素与多因素分析

ANGPTL4是一种新型分泌型蛋白,水解后片段与整合素α5β1相互作用,使Rac/PAK信号通路激活,细胞之间联系减弱,随后该水解片段与紧密连接蛋白、钙黏蛋白结合,使血管内皮细胞屏障功能损伤,血管通透性增强,从而利于肿瘤细胞转移[11]。目前,在乳腺癌、胃癌、肠癌、肝细胞癌等多种恶性肿瘤组织中均发现ANGPTL4蛋白上调表达,证实ANGPTL4在肿瘤发生、发展中起着重要调控作用[12,13,14,15]。然而,也有研究认为在由非癌至癌转化过程中,ANGPTL4蛋白表达与人乳头瘤病毒致癌作用机制无共同路径,所以尽管正常宫颈组织和宫颈癌组织中ANGPTL4蛋白阳性表达率有明显差异,但不能说明ANGPTL4高表达与宫颈癌发生相关[16]。本研究结果显示,宫颈癌组织中ANGPTL4蛋白阳性表达率明显高于正常组织。进一步分析其与宫颈鳞癌临床特征关系发现,ANGPTL4蛋白阳性表达仅与脉管浸润有关,ANGPTL4阳性表达与阴性表达者预后无明显差异,且不是影响预后的独立危险因素。分析原因,可能与宫颈癌组织特异性有关。ANGPTL4在宫颈鳞癌组织中表达上调及其与脉管浸润关系还需进一步探讨。

蛋白激酶CK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,广泛参与细胞多种生理过程,如细胞生长、增殖、凋亡与分化等,且与DNA复制与修复、信号转导、转录调控、肿瘤发生等多种信号通路调控有关。蛋白激酶CK2β是蛋白激酶CK2的调节亚基,介导CK2多种细胞功能,能提高CK2α亚基稳定性,调节CK2α亚基活性,在CK2特异性识别底物及蛋白结合过程中也起到重要作用[17]。刘丽丹[18]在研究中发现,卵巢癌组织中CK2β阳性表达明显高于交界性肿瘤及良性肿瘤,且与临床分期、组织分化程度显著相关。周秋媛等[19]发现宫颈癌组织中CK2βmRNA表达量明显高于癌旁组织,且与增殖基因、凋亡基因表达量直接相关,认为其在宫颈癌组织中上调表达,并与癌细胞增殖、凋亡过程相关。本研究结果显示,宫颈癌组织CK2β蛋白阳性表达率显著高于正常宫颈组织,且CK2β蛋白阳性表达与FIGO分期、分化程度、淋巴结转移明显相关,与陈晓露等[20]研究结果相似,提示CK2β蛋白参与了宫颈鳞癌的发生,并可促进病情进展。进一步经生存曲线分析显示,CK2β蛋白阳性表达者生存率明显低于阴性表达者。经COX多因素分析,CK2β蛋白阳性表达是影响宫颈鳞癌预后的危险因素,考虑与促进肿瘤新生血管形成、促进淋巴结转移有关。

另外,本研究中Foxm1、ANGPTL4和CK2β同时阳性者103例,其5年生存率低于单独任一蛋白阳性者,提示Foxm1、ANGPTL4和CK2β三者对宫颈鳞癌进展的促进可能存在协同作用,具体机制还需进一步探讨。

综上所述,在宫颈鳞癌组织中,Foxm1、ANGPTL4和CK2β蛋白均上调表达,Foxm1、ANGPTL4和CK2β蛋白阳性表达均与宫颈鳞癌不同临床特征相关,其中Foxm1和CK2β蛋白阳性表达对患者预后有明显影响,具有一定的预测价值。

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