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血清lncRNAHLA-DRB6对宫颈鳞癌预后的预测价值

2021-03-08 103 上传者：管理员

摘要：目的:探讨血清HLA-DRB6在宫颈鳞癌无创筛查和预后预测中的价值。方法:回顾性选择2013年2月就诊于我科的3例宫颈鳞癌患者,选取同期就诊的3例妇科疾病患者(子宫内膜异位症)作为对照组,对两组间的血清样本进行长链非表达RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)表达谱分析,筛选差异表达lncRNA。然后挑选出HLA-DRB6,进一步搜集2013年2月至2013年10月就诊于我科的92例宫颈鳞癌患者的血清标本进行验证,并与另54例妇科疾病患者(子宫内膜异位症)对照组进行比较,探讨其诊断效能。根据血清HLA-DRB6表达水平进行分组,比较HLA-DRB6高表达组与HLA-DRB6低表达组的预后。结果:对3例宫颈鳞癌患者和3例对照者的血清lncRNA表达谱进行比较分析,共筛选出764个差异lncRNA,在宫颈鳞癌组上调lncRNA共431个,下调lncRNA共333个。其中HLA-DRB6差异倍数为2.58,在宫颈鳞癌患者血清中表达升高(P=0.001737)。进一步扩大临床样本量验证,结果提示宫颈鳞癌患者的血清HLA-DRB6高于对照组(5.5±1.1vs4.2±1.1,P=0.001)。ROC曲线分析提示其曲线下面积为0.801,灵敏度为89.6%,特异度为62.3%。以6.1为截点分成HLA-DRB6高表达组和HLA-DRB6低表达组,发现HLA-DRB6高表达组患者的5年OS低于HLA-DRB6低表达组(8.9%vs76.4%,P=0.001)。结论:本研究成功筛选了血清HLA-DRB6作为宫颈鳞癌预后预测的无创血清标记物,并与宫颈鳞癌的较高分期有关。

关键词：
HLA-DRB6
妇产科恶性肿瘤
宫颈鳞癌
病理类型
预测价值
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宫颈鳞癌是宫颈癌的主要病理类型,是目前常见的妇产科恶性肿瘤之一,为世界常见的癌症相关死因之一[1]。在过去十余年,大量流行病学研究证实人类乳头状瘤病毒(HPV)与宫颈癌的发生发展相关,其机制主要与HPV诱导的宫颈鳞状上皮细胞基因和染色体不稳定有关。但是基因和染色体不稳定是否是直接的致癌原因,目前尚无定论。此外,超过90%的不稳定性基因是非编码RNA(ncRNA),其大致分为两类:微小RNA(miRNA)[2]和长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)[3]。lncRNA在多种癌肿中差异表达,且在各种癌肿的早期诊断、预后和疗效预测方面已进行了广泛的研究[4,5]。在宫颈鳞癌方面,MAO等[6]运用TCGA进行数据挖掘,发现了多个宫颈鳞癌预后相关基因,包括:BAIAP2-AS1、RP11-203J24.8、LINC01133、RP1-7G5.6、RP11-147L13.15、SERHL、CTC-537E7.3等,但这些基于高通量测序的结论并未进行qPCR低通量验证,存在着较高的假阳性率。此外,目前尚缺乏关于宫颈鳞癌的无创性诊断和预后预测(血清lncRNA)研究。本研究拟首先通过对既往就诊于我科的宫颈鳞癌患者的血清lncRNA表达谱进行分析,筛选出潜在的差异lncRNA,并从中挑选出HLA-DRB6,进一步探讨HLA-DRB6在宫颈鳞癌中的预后预测价值,旨在探索针对宫颈鳞癌的筛选和预后预测标记物。

1、资料与方法

1.1资料来源

回顾性收集2013年2月就诊于我科的TNM分期为III期的宫颈鳞癌患者3例,选取同期就诊的3例妇科疾病患者(子宫内膜异位症)作为对照组,搜集其血清样本,对两组间的血清样本进行lncRNA表达谱分析,筛选差异表达lncRNA。然后挑选出HLA-DRB6,进一步搜集2013年2月至2013年10月就诊于我科的92例宫颈鳞癌患者的血清标本进行验证,并与另54例妇科疾病患者(子宫内膜异位症)对照组进行比较,探讨其诊断效能。然后根据血清HLA-DRB6表达水平进行分组,比较HLA-DRB6高表达组与HLA-DRB6低表达组患者的预后。纳入标准:①病理确诊为宫颈鳞癌;②年龄≥15岁。排除标准:①合并多原发癌;②既往有其他恶性肿瘤史。

1.2试剂和设备

血清RNA提取试剂盒(Qiagen217184,Qiagen公司),AgilentHumanlncRNAMicroarray芯片,NanoDrop2000分光光度计(美国AppliedBiosystems公司),PrimeScriptRTreagentKit(日本Takara公司),PCR仪(上海生工公司),SYBRPremixExTaqIIKit(日本Takara公司)。

1.3qRT-PCR检测

清晨空腹取外周血5mL加入离心管,4℃下以4000×g离心10min,吸取上清转至2mL离心管中,-80℃保存。按照血清RNA提取试剂盒说明书提取血清样本总RNA,并定量测定RNA浓度和纯度。当吸光度A260nm/A280nm为1.9～2.1时选择用于进行进一步分析。lncRNA芯片检测由上海欧易生物科技有限公司完成,差异lncRNA的标准为差异倍数1.2倍以上且P<0.05。进一步挑选HLA-DRB6进行qRT-PCR验证,根据PrimeScriptRTreagentKit和SYBRPremixExTaqIIKit说明书逆转录提取RNA后进行qRT-PCR,以18SrRNA为内参。

1.4治疗方法

根据TNM临床分期决定治疗方式,I-IIa期行宫颈癌根治术,IIb-IV期采用放化疗为主的综合治疗。

1.5统计学方法

计数资料采用卡方检验进行比较。采用X-tile3.6.1软件[7]进行HLA-DRB6的截点设置,并根据设置的截点分成高表达组和低表达组。绘制人工受试者曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC),计算曲线下面积(areaundercurve,AUC),评价HLA-DRB6对宫颈鳞癌的预后预测作用。生存分析采用KaplanMeier法绘制生存曲线图,生存曲线采用logrank法进行比较,统计学处理采用SPSS18.0软件。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1血清lncRNA表达谱分析

对3例宫颈鳞癌患者和3例对照者的血清lncRNA表达谱进行比较分析,共筛选出764个差异lncRNA(图1和图2),在宫颈鳞癌组上调lncRNA共431个,下调lncRNA共333个。其中HLA-DRB6差异倍数为2.58,在宫颈鳞癌患者血清中表达升高(P=0.001737),见表1。因此,选择HLA-DRB6进一步分析。

图1差异表达lncRNA的火山图

图2宫颈鳞癌患者和对照组的血清差异lncRNA热图

2.2扩大样本后血清标本分析

进一步搜集2013年2月至2013年10月146例血清标本进行qPCR验证,包括92例宫颈鳞癌和54例对照组。宫颈鳞癌患者的血清HLA-DRB6水平高于对照组(5.5±1.1vs4.2±1.1,P=0.001),详见图3。ROC曲线分析提示其曲线下面积为0.801,灵敏度为89.6%,特异度为62.3%,具有较高的预测效能,见图4。

表1宫颈鳞癌患者和对照组的血清差异lncRNA

图3宫颈鳞癌患者和对照组的血清HLA-DRB6表达比较

图4血清HLA-DRB6预测宫颈鳞癌的ROC曲线分析

2.3HLA-DRB6高表达组与低表达组患者的预后分析

根据血清HLA-DRB6表达水平进行分组,比较HLA-DRB6高表达组与低表达组宫颈鳞癌患者的预后。以5年总生存率(overallsurvivalrate,OSrate)为终点结局事件,运用X-tile软件对HLA-DRB6的表达水平进行截点设置,结果提示:HLA-DRB6相对表达值=6.1为最佳分组截点,进一步以6.1为截点分成HLA-DRB6高表达组与HLA-DRB6低表达组,对两组患者的5年OS率进行比较,结果提示HLA-DRB6高表达组患者的5年OS率低于HLA-DRB6低表达组(8.9%vs76.4%,P=0.001),见图5。

图5HLA-DRB6预测宫颈鳞癌预后的X-tile分析结果和生存分析

2.4HLA-DRB6高表达组和低表达组患者临床病理资料比较

对HLA-DRB6高表达组和低表达组患者的临床病理资料进行比较,结果提示,两组间年龄、肿瘤大小、肿瘤分级差异无统计学意义。HLA-DRB6高表达组患者的III-IV期所占比例高于HLA-DRB6低表达组(P=0.001),见表2。

3、讨论

目前认为,宫颈鳞癌的发生是环境和基因不稳定性相结合造成的[8]。其进展常由正常宫颈上皮,感染HPV后形成HPV感染状态的宫颈上皮,进一步进展为宫颈癌前病变。此时所有过程均是可逆的,如致癌因素未及时清除,则进一步发展为宫颈癌。在这一系列进展过程中,有多种肿瘤标记物,如SSC-Ag、CA125、CEA、多种细胞角蛋白检测(TPA、TPS、Cyfra21-1)的升高与肿瘤的进展情况相关,但其大多于临床III-IV期才能进行检测[8,9]。

此外,新的肿瘤标记物(如lncRNA)被不断的发掘,在多个瘤肿的临床运用有一些小样本的研究[10,11]。lncRNA主要在转录后水平调节基因的表达水平[12]。WANG等[11]发现lncRNAHULC在宫颈癌组织中上调,且其上调与更高的FIGO分期、淋巴结转移和宫颈癌侵犯深度,以及宫颈癌患者不良预后相关。ZHANG等[13]发现与癌旁组织相比,lncRNAFEZF1-AS1在宫颈癌组织中上调,且FEZF1-AS1高表达与较差的病理类型、较高的远处转移和更高的肿瘤分期相关。但以上这些研究均基于宫颈癌术后标本,临床需行病理学活检才能检测。目前尚缺乏关于无创lncRNA运用于宫颈癌诊断的尝试。本研究首先通过对3例宫颈鳞癌患者和3例非癌对照者的血清lncRNA表达谱进行比较分析,筛选出HLA-DRB6进行进一步研究。结果提示:宫颈鳞癌患者的血清HLA-DRB6水平高于非癌对照组(P=0.001)。ROC曲线分析提示其曲线下面积为0.801,灵敏度为89.6%,特异度为62.3%,具有较高的预测效能。有望为今后进一步临床研究和临床应用提供参考。

表2血清HLA-DRB6高表达组和低表达组患者的临床病理资料比较

鉴定出能预测宫颈鳞癌患者预后的标记物,有助于临床治疗方案和随访计划的制定[14]。本研究中,以6.1为截点将纳入患者分成HLA-DRB6高表达组和HLA-DRB6低表达组,对两组间的5年OS进行比较,结果提示HLA-DRB6高表达组患者的5年OS低于HLA-DRB6低表达组(8.9%比76.4%,P=0.001),且HLA-DRB6高表达组的III-IV期所占比例高于HLA-DRB6低表达组(P=0.001)。提示HLA-DRB6有助于初步判断宫颈鳞癌的分期和预后。目前认为HLAII类等位基因多态性参与了宫颈鳞癌基因不稳定性的发生,从而参与了肿瘤的发展过程,HLA-DRB1*13和HLA-DRB1*3(17)为宫颈癌的高危因素,而DRB1*09012和DRB1*1201人群的宫颈癌患癌风险较低[15]。HLA-DRB6是该家族中最后被鉴定出的成员,其在宫颈癌中的应用尚未见报道[16]。WANG等[16]发现DRB可通过P-TEFb抑制SIRT1/CK2α,从而增加人类癌细胞株的放疗敏感性,但HLA-DRB6是否有助于临床放疗耐药靶标的设计,仍需进一步临床研究以确定。而HLA相关基因的上调可作为免疫应答的始动分子,促使肿瘤免疫和免疫耐受[17]。因此,对HLA-DRB6免疫原性的研究,有助于设计临床治疗靶标,提高临床疗效[18,19,20]。

综上所述,本研究成功筛选了血清HLA-DRB6作为宫颈鳞癌预后预测的无创血清标记物,并与宫颈鳞癌的较高分期有关。

何芳.血清lncRNAHLA-DRB6对宫颈鳞癌预后的预测价值[J].现代肿瘤医学,2021,29(08):1365-1369.