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宫颈癌化疗近期疗效差异与DNA聚合酶ζ亚基REV3基因多态性的关系

2021-09-30 87 上传者：管理员

摘要：目的探究宫颈癌近期化疗效果差异与DNA聚合酶ζ(Polζ)亚基REV3基因多态性的关系。方法选取2018年1月至2019年12月河南省南阳市中心医院收治的96例宫颈癌患者(宫颈癌组),治疗前均采血提取基因组DNA,检测Polζ亚基REV3基因(rs181294、rs240966、rs465646)多态性,与同期收治的50例同龄正常体检者进行对照,分析遗传平衡情况;所有宫颈癌患者均给予铂类化疗,4个周期后评估化疗疗效,按治疗效果分为敏感组与非敏感组,分析近期疗效与REV3基因多态性的关系。结果宫颈癌组REV3rs181294位点G/A型、A/A型及A等位基因频率高于对照组,rs465646位点A/G、G/G基因型及G等位基因频率高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。携带REV3rs181294位点A/A基因型宫颈癌易感风险高于携带G/G型(P<0.05);携带rs465646位点A/G、G/G基因型宫颈癌易感风险高于携带A/A型(P<0.05);携带REV3rs181294位点A型等位基因宫颈癌易感风险高于携带G等位基因(P<0.05);携带rs465646位点G等位基因宫颈癌易感风险高于携带A等位基因(P<0.05),差异均有统计学意义。96例宫颈癌患者完全缓解8例(8.33%),部分缓解41例(42.71%),稳定40例(41.67%),进展7例(7.29%)。敏感组REV3rs181294位点G/A型、A/A型及A等位基因频率高于非敏感组,rs465646位点A/G、G/G基因型及G等位基因频率低于非敏感组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论携带Polζ亚基REV3rs181294位点G/A型、A/A型及A等位基因及rs465646位点A/G、G/G基因型及等位基因G均可能增加宫颈癌易感性及铂类化疗不敏感风险。

关键词：
DNA聚合酶ζ
REV3基因
化疗
多态性
宫颈癌
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宫颈癌患病率位居女性生殖系统恶性肿瘤前3位，全球每年宫颈癌新发病例超50万，死亡病例超26万。化疗是局部晚期宫颈癌治疗的主要手段，对控制肿瘤进展、预防宫颈癌复发、转移有积极作用。但仍有较大一部分宫颈癌患者对化疗不敏感，影响其预后。近年来，越来越多证据显示，DNA损伤修复基因通过多途径影响化疗药物敏感性。DNA损伤修复系统涉及直接修复、错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复等，其中跨损伤DNA合成通路基因在严重创伤修复中的作用越来越得到重视，已证实与含铂类药物化疗耐药及放疗抵抗有密切关联。DNA损伤修复为DNA自身修复的主要方式，修复过程由Y家族及B家族多种聚合酶参与，主要包括Y家族REV1,B家族DNA聚合酶ζ(polymeraseζ,Polζ),属旁路修复，过程包括DNA聚合酶转换、碱基掺入及聚合酶延伸、解离。其中Polζ为TLS修复过程关键参与者，含REV3L蛋白及REV7L蛋白亚基，前者为催化亚基，与REV7L蛋白结合后结构重排，产生与REV1蛋白结合位点，介导DNA损伤部位碱基转换，与REV蛋白相互作用，募集Polζ至DNA损伤部位，产生延伸作用。体外研究发现，敲除REV3基因后，癌细胞对顺铂药敏增加。食管癌细胞试验中也得到相同结果[7]。推测上述跨损伤DNA合成途径对化疗药物敏感性产生影响。但对宫颈癌化疗效果与Polζ亚基REV3基因多态性的关系尚未阐明。本研究对Polζ亚基REV3基因多态性与宫颈癌近期疗效的关系展开研究，以期为宫颈癌治疗提供分子学依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2018年1月至2019年12月河南省南阳市中心医院收治的宫颈癌患者96例(宫颈癌组)。纳入标准：年龄>20岁；经病理确诊为宫颈鳞癌，国际妇产科联盟分期Ⅱ～Ⅳa期[8];既往未接受手术或抗肿瘤治疗；无近期妊娠史；无其他部位肿瘤病史；临床资料完整。排除标准：复发或转移性宫颈癌；生殖系统畸形；自身免疫功能缺陷；恶液质；心肝肾肺器质性功能障碍；严重贫血(血红蛋白浓度为30～60g/L);严重脑血管病如脑血管破裂、脑出血或急性脑梗死等；治疗过程中出现无法耐受毒副反应退出者；资料不全。宫颈癌组患者年龄22～68岁，平均(49.51±7.98)岁；按照国际妇产科联盟分期[8]:Ⅱ期35例，Ⅲ期50例，Ⅳa期11例；病理分化程度：高分化31例，中分化46例，低分化19例。并选择同期体检的50例正常健康女性作为对照组，家族无宫颈癌病史，体健，年龄20～67岁，平均(48.97±8.41)岁。两组研究对象性别、年龄等基线情况均衡可比(P>0.05)。

1.2治疗方法

所有宫颈癌组患者均接受顺铂+紫杉醇化疗方案，第1天，紫杉醇(华北制药股份有限公司生产，国药准字H20084439)135～175mg/m2,3h滴注完毕；第2天，顺铂(江苏豪森药业股份有限公司生产，国药准字H20010743)50～70mg/m2,静脉化疗。每3周重复，共化疗4个周期后评估疗效。

1.3Polζ亚基REV3基因多态性检测方法

结合既往报道及国际人类基因组单体型图计划(Haplotypemap,即HapMap计划)所公布汉族人群数据库中筛选Polζ亚基REV3单核苷酸多态性位点，设定条件：最小等位基因频率>0.1,连续不平衡参数r2>0.8,筛选rs181294、rs240966、rs465646共3个基因位点，DNA序列上美国国立生物技术信息中心GenBank查询并确定。宫颈癌组于化疗前采集外周静脉血5mL,对照组于体检当日采集，枸橼酸钠抗凝管保存，提取外周血白细胞全基因组DNA[DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司],浓度及纯度满意后，采用实时荧光定量聚合酶链反应法法进行基因扩增，TaqmanMGB探针对筛选Polζ亚基REV3rs181294、rs240966、rs4656463个位点基因多态性进行分型(散点图、扩增曲线双验证)[9],并采用美国ABI公司1377型测序仪进行DNA直接测序验证基因分型的准确性。

1.4近期疗效评估

宫颈癌组于化疗结束1周内评估治疗疗效，参照实体瘤疗效标准[10]。完全缓解：所有目标可测病灶总和缩小至正常范围，可测病灶完全消失；部分缓解：所有可测病灶径线总和(目标结节测定用短径，其他目标病灶使用长径)较基线缩小30%以上；稳定：可测病灶径线总和缩小不超过30%或增大不超过20%;进展：可测病灶径线总和较基线增加20%,或有新病灶出现。以完全缓解和部分缓解视为化疗敏感，作为敏感组；稳定或进展视为化疗不敏感，作为非敏感组。

1.5统计学方法

数据统计分析采用SPSS24.0软件。Polζ亚基REV3位点基因型分布采用Hardy-Weinberg遗传平衡性检验确定样本群体代表性；Polζ亚基REV3基因型及等位基因分布采用例或率表示，组间对比用χ2检验；非条件logistic回归模型计算相对风险比值比(oddsratio,OR)及95%可信区间。检验水准α=0.05,双侧检验。

2、结果

2.1两组研究对象Polζ亚基REV3基因Hard-Weinberg遗传平衡性检验

Hard-Weinberg遗传平衡性检验结果显示，宫颈癌组与对照组Polζ亚基REV3基因rs181294、rs240966、rs465646位点基因型分布与预计值比较差异均无统计学意义(P>0.05),满足Hard-Weinberg遗传平衡性要求，具有群体代表性。见表1。

2.2两组研究对象Polζ亚基REV3基因型分布比较

宫颈癌组、对照组Polζ亚基REV3rs240966位点基因型分布比较差异无统计学意义(P>0.05),rs181294、rs465646位点基因型分布比较差异有统计学意义(P<0.05),宫颈癌组rs181294位点G/A型、A/A型频率高于对照组，rs465646位点A/G、G/G基因型频率高于对照组(P<0.05)。见表2。

2.3宫颈癌易感性与Polζ亚基REV3基因型分布的关系

携带Polζ亚基REV3rs240966位点不同基因型分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。以G/G型为参照，携带REV3rs181294位点A/A基因型可增加宫颈癌易感风险2.713倍；以A/A型为参照，携带rs465646位点A/G、G/G基因型增加宫颈癌易感风险4.015、3.571倍(P<0.05)。见表3。

2.4宫颈癌易感性与Polζ亚基REV3等位基因分布的关系

携带Polζ亚基REV3rs240966位点不同等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。以G等位基因为参照，携带REV3rs181294位点A型等位基因可增加宫颈癌易感风险1.765倍(χ2=8.543,P<0.05);以A等位基因为参照，携带rs465646位点G等位基因增加宫颈癌易感风险2.536倍(χ2=11.411,P<0.05)。见表4。

2.5宫颈癌化疗近期效果与Polζ亚基REV3基因型分布的关系

近期化疗效果，96例宫颈癌患者完全缓解8例(8.33%)、部分缓解41例(42.71%)、稳定40例(41.67%)、进展7例(7.29%),分为敏感组(n=49)与非敏感组(n=47)。敏感组与非敏感组rs240966位点基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05);以G/G为参考，携带rs181294位点G/A基因型、A/A基因型可增加化疗不敏感风险2.776、5.591倍(χ2=22.856、19.600,P均<0.05);以A/A为参照，携带rs465646位点A/G、G/G基因型可增加宫颈癌化疗不敏感风险2.419、4.369倍(χ2=5.229、4.721,P均<0.05)。见表5。

2.6宫颈癌化疗近期效果与Polζ亚基REV3等位基因频率分布的关系

敏感组与非敏感组携带Polζ亚基REV3rs240966位点基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。以G等位基因为参照，携带REV3rs181294位点A型等位基因可增加化疗不敏感风险2.551倍(χ2=25.975,P<0.05);以A等位基因为参照，携带rs465646位点G等位基因增加化疗不敏感风险1.714倍(χ2=4.623,P<0.05)。见表6。

3、讨论

DNA聚合酶是参与机体跨损伤DNA合成通路复制后修复过程的重要酶类，可通过适应模板DNA损伤，依据损伤结构及不同聚合酶偏好引入碱基或造成突变。与基因组稳定性及DNA突变均有关联。Polζ是近年来研究较多，与TLS通路功能有关的DNA聚合酶，可通过聚合酶转换，降低损伤部位低保真度DNA聚合酶复制延伸，保持基因组稳定性，但不可避免诱导DNA突变。基础研究发现，脑胶质瘤组织中Polζ亚基REV3基因表达高于正常组织，且大部分存在错配修复缺陷，推测Polζ亚基REV3与肿瘤发生有关。近期也有报道发现，REV3基因多态性与卵巢癌、乳腺癌易感性有关。但对Polζ亚基REV3对宫颈癌化疗敏感性的影响尚未明确。

铂类尤其顺铂系宫颈癌化疗一线基础药物，通过DNA双链链内及链间交联捕获癌细胞周期，诱导癌细胞凋亡，但癌细胞铂类药物耐药导致其推广受限[16]。癌细胞对DNA损伤修复能力直接影响化疗敏感性，癌细胞突变率上升是导致癌细胞化疗耐药的主要原因[17]。TLS通路作为修复DNA损伤关键通路可能为参与癌细胞耐药的重要机制。前期研究[18]发现，REV3基因影响结肠癌、肺癌等多种癌细胞株克隆合成，敲除REV3基因可减缓细胞G1/S期增殖速度，减少细胞克隆形成，而过表达则可促进克隆形成。Jiang等[19]表示，肺癌模型REV3rs465646位点基因突变与顺铂耐药有关。本研究结合以往文献报道及数据库筛查结果选择Polζ亚基REV33个位点基因多态性与宫颈癌化疗效果关系进行探究，结果发现，携带rs181294、rs465646位点基因突变与宫颈癌易感性及宫颈癌化疗不敏感有关，与王瑛等[20]报道REV3在卵巢癌中作用的结论相似，说明Polζ亚基REV3基因部分位点基因遗传变异可能与卵巢癌发病及治疗效果有关，推测跨损伤DNA合成通路在宫颈癌细胞铂类化疗耐药中存在特异性，携带Polζ亚基REV3rs181294位点G/A基因型+A/A基因型及等位基因A均可能增加宫颈癌易感性，降低化疗敏感度；携带rs465646位点A/G+G/G基因型及等位基因G人群宫颈癌易感性更高，有更低的化疗敏感性。进一步推测该位点基因突变可影响TLS通路DNA修复能力，在修复铂类化疗方案所致DNA交联时，携带rs181294位点G/A+A/A基因型、A等位基因及携带rs465646位点A/G+G/G基因型及等位基因G宫颈癌患者Polζ亚基REV3可通过诱导多种碱基替换途径引起癌细胞自发突变，增加宫颈癌易感性及癌细胞化疗药物耐药，影响近期疗效。此外，REV3上述位点基因突变可能影响DNA修复损伤过程碱基序列，导致REV3基因茎环结构改变，降低其转录效率，影响化疗敏感性。

综上，Polζ亚基REV3rs181294、rs465646位点基因多态性与宫颈癌易感性及铂类化疗近期疗效有关，携带rs181294位点G/A+A/A基因型、A等位基因及携带rs465646位点A/G+G/G基因型及等位基因G患者有更高的宫颈癌易感风险及铂类化疗药物不敏感风险，可作为宫颈癌易感人群筛查及化疗敏感性筛查的依据。但马晓璐[22]表示，人REV3基因受环境因素影响较大，可对环境因子产生应激应答反应造成细胞突变。但本研究尚未分析环境因素对Polζ亚基REV3突变的影响，后续需进一步扩充样本量，探究REV3基因突变对宫颈癌易感性及化疗效果影响的确切机制。