核转录因子X框结合蛋白1(nuclear transcription factor, X-box binding 1,NFX1)又称NFX2、Tex42和TEG-42,是一种富含半胱氨基酸的可与MHC II类基因中的保守启动子X框结合的转录抑制因子。NFX1基因在角化细胞和上皮细胞中可表达两种蛋白，分别为长剪切变体NFX1-123和短剪切变体NFX1-91[1]。NFX1-123全长1 121个氨基酸残基，N端具有PAM2(Abbr)结构域，是蛋白质与细胞质多聚物(A)结合蛋白[cytoplasmic poly(A) binding proteins, PABPCs]结合所必需的；中央结构域包含1个PHD/RING(Abbr)结构域，具有E3泛素连接酶的功能；此外，还包含6个富含半胱氨酸的锌指样结构域是DNA结合所需要的；C端包括2个额外的锌样指结构域和1个R3H结构域，该结构域被认为具有单链核酸结合能力[2,3]。

宫颈癌是女性癌症死亡的重要原因[4]。近年来，研究发现NFX1可能在高危型人乳头瘤病毒(high risk-human papilloma virus, HR-HPV)引起的宫颈癌的发生发展中起到重要作用。NFX1通过中心结构域与HPV16 E6蛋白结合。其中，NFX1-91被16E6和E3泛素连接酶E6关联蛋白(E6-associated protein, E6AP)通过泛素化迅速降解。而NFX1-123则不会被泛素化降解[5],并且在HPV阳性的原发性宫颈癌和宫颈癌细胞系中高表达[6]。因此，更多的研究关注NFX1-123在HR-HPV感染的宫颈癌中的作用。端粒酶表达和活性随着宫颈病变的发展而增加[7,8,9,10]。研究发现NFX1-123和PABPCs结合协同增强了HPV16 E6介导的端粒酶表达调节和活性调节[1,11]。在HPV16 E6的共表达时，NFX1-123通过HPV介导的hTERT mRNA的转录后稳定来增加端粒酶。HPV16阳性宫颈癌细胞系敲除了NFX1-123后，细胞生长速度减慢，端粒酶活性降低[6]。上述有关NFX1-123和HPV16 E6的研究有可能支持探索以宫颈癌为代表的HPV相关癌症的发生和发展。

本实验拟构建NFX1-123真核表达重组质粒，使用Western blot检测NFX1-123蛋白表达和免疫荧光的方法观察其亚细胞定位，通过免疫共沉淀(immunocoprecipitation, IP)验证NFX1-123和HPV16 E6的相互作用，为进一步研究NFX1-123和HPV16 E6复合物在支持和维持HPV相关恶性肿瘤中所起的关联作用提供基础，将有助于确定促使HR-HPV感染的上皮细胞向宫颈癌转化的因素。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系

HEK-293T细胞、nHA/pRK5载体由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤室保存。

1.1.2主要试剂

大肠杆菌DH5α感受态细胞、Ex Taq酶、dNTPs Mix、10×PCR Buffer、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性内切酶(TaKaRa公司),DNA片段纯化试剂盒、DNA凝胶电泳回收试剂盒(Qiagen公司),质粒小提试剂盒(Tiangen),高糖DMEM培养基、胎牛血清、GlutamaxTM、含0.25%EDTA的胰酶、Opti-MEM培养基(Gibco),DNA转染试剂X-treme GENE DNA Transfer Reagent(Roche公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天),NFX1抗体(Proteintech公司),HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)、山羊抗兔IgG(H+L)抗体、山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor®555)(Abcam),HA抗体、β-actin抗体(Sigma-Aldrich),ECL发光液(Millipore公司)。

1.2实验方法

1.2.1引物设计与合成

根据NFX1-123序列(Accession No.NM_002504.6)的功能编码区(CDS区)序列，设计了在5'端加入保护碱基的上游引物(5'-TCGAAGATCTATGGCGGAGGCGCCTCCTGTCTCAG-3')和下游引物(5'-GCGTCGACGTCCTGGACGTCAAAATAGTC-3')。引物由上海生工(生物)工程有限公司合成。

1.2.2 NFX1-123基因PCR扩增

将引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增体系(20μL)为：cDNA模板2μL,2×Taq Mix 10μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10μmol/L)1μL,RNase-free Water定容至20μL。将PCR扩增终产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，获得NFX1-123片段。

1.2.3 nHA-NFX1-123/pRK5真核表达质粒构建

分别取含有目的基因(NFX1-123)的PCR产物和空载体质粒nHA/pRK5,分别用BglII+Sal I、BamHI+Sal I限制性内切酶进行双酶切，37℃2 h。用1%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段和线性载体，回收目 的片段与质粒载体(比例为5∶1摩尔浓度比)进行连接重组，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄抗性的LB培养板上，挑取单克隆菌群进行摇菌，提取重组质粒。

1.2.4重组质粒的鉴定

对重组质粒nHA-NFX1-123/pRK5分别进行Pvu I单酶切和EcoRV+EcoR I双酶切鉴定。最后，将阳性重组质粒送往北京华大基因进行DNA序列测定，利用NCBI网址上的Nucleotide BLAST进行序列比对分析，最终确定重组质粒构建成功与否。

1.2.5 HEK-293T细胞培养及转染

使用加入10%FBS、200μg/mL Glutamax和100 U/mL青链霉素的高糖DMEM培养基，在10 cm细胞培养皿中培养HEK-293T细胞，待细胞汇合度达到90%左右进行细胞传代。按照X-treme GENE DNA Transfer Reagent转染试剂说明书设计并转染质粒，转染48 h后提取总蛋白。

1.2.6 Western blot检测NFX1-123蛋白表达

BCA法进行蛋白定量，进行SDS-PAGE,电泳后转至甲醇激活的PVDF膜，5%脱脂奶 粉室温封闭1 h, PBST洗涤3次，每次10 min。分别1∶1 000稀释HA抗体 和1∶5 000稀释β-actin抗体，4℃孵育过夜。用PBST洗 膜3次，每次10 min。二抗室温孵育1 h,用PBST洗膜3次，每次10 min。ECL显色，使用ECL发光成像系统采集图像。

1.2.7免疫共沉淀实验

转染48 h后，收集细胞提取蛋白，每500μL蛋白加入20μL抗HA亲和凝胶，置于侧摇摆床上4℃孵育过夜，8 000 r/min离心1 min,弃上清，加入500μL TBS缓冲液洗涤，共洗涤三次，加入40μL RIPA裂解液和10μL 5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，与Input一起95℃水浴5 min,离心取上清液，进行Western blot,用HA标签抗体和GFP标签抗体分别进行检测。

1.2.8免疫荧光实验

将重组质粒转染到HEK-293T细胞中，转染48 h后用PBS清洗细胞1次，滴加4%多聚甲醛室温固定30 min。用PBS洗涤3次，5 min/次，0.5%Triton X-100透膜15 min。用PBS洗涤3次，5 min/次，0.5%BSA封闭30 min。用PBS洗涤3次，5 min/次，HA抗体室温孵 育1 h。用PBS洗涤3次，5 min/次，二抗室温避 光孵育1 h。用PBS洗 涤3次，5 min/次，DAPI室温孵育10 min。用PBS洗涤3次，10 min/次，添加抗荧光淬灭剂，封片。在激光扫描共聚焦显微镜下拍照。

2、结果

2.1 NFX1-123基因扩增及真核表达质粒的构建

设计引物，PCR扩增目的基因。1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，约3 300 bp处出现扩增条带，与预测目的片段大小一致。重组真核表达质粒nHA-NFX1-123/pRK5经Pvu I单酶切和EcoRV+EcoR I双酶切后的DNA电泳结果见图2,酶切片段与预测片段大小一致。质粒测序结果经BLAST比对与GenBank检索获取的目的基因序列完全一致。

图1 PCR扩增NFX1-123基因  

图2重组质粒nHA-NFX1-123/pRK5酶切鉴定  

Western blot结果显示，与转染nHA/pRK5空载体质粒组和未转染质粒组相比，转染了nHA-NFX1-123/pRK5质粒组采用HA标签抗体检测后在123 kD处出现特异性条带，表明NFX1-123目的蛋白表达成功(图3)。

2.2 NFX1-123蛋白在HEK-293T细胞中的定位

在HEK-293T细胞中转染nHA-NFX1-123/pRK5质粒，转染48 h后进行免疫荧光检测，通过激光扫描共聚焦显微镜观察NFX1-123蛋白在细胞内的定位，可观 察到NFX1-123蛋白主要表达在HEK-293T细胞的细胞质中(图4)。

图3 Western blot检测HEK-293T细胞中NFX1-123蛋白的表达  

图4 NFX1-123蛋白在HEK-293T细胞中的定位(×400) 

2.3 NFX1-123与HPV16 E6的免疫共沉淀

Western blot结果显示，抗HA亲和凝胶免疫共沉淀后，采用抗GFP标签抗体检测，HA-NFX1-123和GFP-HPV16 E6质粒共转染组可检测到条带，蛋白大小与GFP-HPV16 E6蛋白一致；而未转染质粒的对照组、转染GFP-HPV16 E6质粒和转染HA-NFX1-123质粒组均未检测到GFP-HPV16 E6蛋白对应条带(图5)。Input组Western blot结果显示，HA-NFX1-123和GFP-HPV16 E6蛋白均可正常表达(图5)。表明NFX1-123与HPV16 E6在细胞内存在相互作用。

2.4免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察NFX1-123蛋白与HPV16 E6的共定位

为了进一步验证NFX1-123和HPV16 E6两者的相互作用关系，我们采用了免疫荧光观察两个蛋白质在细胞内的定位(图6)。结果显示，当HPV16 E6与NFX1-123共表达时，NFX1-123在HEK-293T细胞中的定位发生明显变化，NFX1-123出现在细胞核中，并且NFX1-123的红色荧光和GFP标签相连的HPV16 E6的绿色荧光在细胞核中重合，两者的荧光形态及定位一致，NFX1-123与pEGFP-N1空载体共表达时无此现象，表明NFX1-123与HPV16 E6共表达，NFX1-123可以从细胞质迁移至细胞核，与细胞核中的HPV16 E6发生共定位。这也进一步 证明HPV16 E6与NFX1-123之间存在相互作用，且HPV16 E6会影响NFX1-123的亚细胞定位，使其从细胞质迁移至细胞核并与细胞核中的HPV16 E6发生共定位。

图5 NFX1-123与HPV16 E6的免疫共沉淀实验  

图6 NFX1-123与HPV16 E6在HEK-293T细胞内的共定位(×400)  

3、讨论

NFX1-123在HPV相关的癌症发生中发挥着重要作用，例如宫颈癌和头颈部肿瘤等[6,12]。更多的研究发现，NFX1-123的表达变化也可能发生在其他类型的癌症中[13,14,15,16]。因此，NFX1-123可能在致癌过程中发挥着普遍的作用，而HPV16 E6蛋白利用了NFX1-123的生物学功能促进了宫颈癌和头颈部肿瘤的发生发展。在HPV16 E6共表达的情况下，NFX1-123通过增加上皮细胞分化的重要调节因子Notch1[17]并上调下游分化途径和靶点[1]、协同HR-HPV在mRNA和蛋白水平下调促炎细胞因子及干扰素刺激的基因表达[18]和抑制HR-HPV的免疫反应[19]上来逃避免疫监视和检测等，多途径促进HR-HPV感染的宫颈上皮向宫颈癌发生。

KATZENELLENBOGEN等人[20]通过在293T细胞中瞬转NFX1-123与HPV16 E6,免疫共沉淀发现两者存在结合，GST pull-down实验发现体外翻译的NFX1-123通过其中心结构域与HPV16 E6结合。但目前，仍鲜有文献报道两者的细胞定位关系。在本研究中，我们通过免疫共沉淀实验验证NFX1-123和HPV16 E6的相互作用，结果证实NFX1-123可与HPV16 E6结合，与此前的研究结果相符。HPV16 E6蛋白主要存在于细胞核[21,22,23,24]。本研究通过 免疫荧光实验进一步首次观察到了HPV16 E6可能会影响NFX1-123的亚细胞定位：从细胞质到细胞核，而此前的研究发现NFX1-123蛋白主要存在于细胞质中，而未进一步发现其可能存在迁移情况。我们认为：NFX1-123发生由细胞质到细胞核的定位改变的现象与HPV16 E6和NFX1-123的共表达相关，且与HPV16 E6共表达时NFX1-123的细胞定位迁移共定位现象的发现进一步补充解释了为何主要定位于细胞质中的NFX1-123可通过其中心结构域与细胞核中的HPV16 E6结合[21,22,23,24],最终通过上述的调节端粒酶活性、增加上皮细胞分化、调节炎症因子和抑制免疫反应等多条信号通路促进HR-HPV感染的宫颈上皮向宫颈癌发生。

目前，关于NFX1-123和HPV16 E6共表达且共定位的现象，存在以下生物学功能的假说：第一，两者相互作用可能增加NFX1-123在细胞内对hTERT mRNA的招募，从而改变NFX1-123的蛋白质折叠及其暴露的结构域；第二，HPV16 E6相关癌症中去泛素化酶USP9X增加，并通过其高效的去泛素化作用与NFX1-123蛋白相互作用而稳定且保持更多的NFX1-123表达[25]。这些假说目前均未得到证实。因此，我们后续实验将进一步探究NFX1-123和HPV16 E6复合物在宫颈癌细胞系中的相互作用及其可能的机制。

综上所述，本研究成功构建NFX1-123重组质粒，可在真核细胞系统中过表达NFX1-123蛋白且主要定位于细胞质中，免疫共沉淀法的方法验证了HPV16 E6与NFX1-123之间存在相互作用，对NFX1-123的功能进行了初步确认。免疫荧光实验发现HPV16 E6能够影响NFX1-123的亚细胞定位，使其从细胞质转移至细胞核，且两者共定位于细胞核，这在HPV16阳性的宫颈上皮向宫颈病变甚至宫颈癌发展中起至关重要的作用。课题组将进一步确定NFX1-123和HPV16 E6复合物的生物学功能，为后续研究NFX1-123在HR-HPV感染细胞系中的功能及在宫颈癌发生和发展中的相关机制提供依据。

基金资助:海南省自然科学基金面上项目(编号:820MS127);

文章来源:李娇生,郭一帆,于浩天.HPV阳性宫颈癌细胞中NFX1-123与HPV16 E6的细胞定位关系及其可能作用机制[J].现代肿瘤医学,2023,31(16):2972-2976.