中晚期宫颈癌患者预后较差，早期诊断及治疗是提高宫颈癌患者生存率的关键措施[1,2]。长链非编码RNA(LncRNA)在宫颈癌发生过程中发挥重要作用[3,4]。LncRNA LINC00161在多种恶性肿瘤中表达水平升高，其高表达量与患者预后不良及细胞迁移、侵袭密切相关[5,6,7]。靶基因预测显示微小RNA-590-3p(miR-590-3p)与LINC00161存在结合位点，miR-590-3p在宫颈癌细胞中表达水平降低[8]。目前，LINC00161是否通过调控miR-590-3p表达而影响宫颈癌的发生、发展及转归尚无相关研究。本研究旨在探讨宫颈癌发生过程中LINC00161对miR-590-3p的靶向调控作用。

1、材料与方法

1.1 材料来源

选择2017年12月—2018年12月在上海市闵行区中心医院接受根治术的37例宫颈癌患者为研究对象，年龄50～68岁，平均年龄(54.68±6.59)岁。取癌组织及癌旁组织样本，置于-80 ℃超低温冰箱内保存待测。宫颈癌SiHa细胞购自美国ATCC细胞库；cDNA、qRT-PCR试剂购自日本TaKaRa公司；MTT试剂购自北京百奥创新科技有限公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术股份有限公司；Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司；Matrigel基质胶购自北京启研生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher Scientific。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

根据转染靶标将宫颈癌SiHa细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-LINC00161组(转染si-LINC00161)、si-LINC00161+anti-miR-NC组(转染si-LINC00161和anti-miR-NC)、si-LINC00161+anti-miR-590-3p组(转染si-LINC00161和anti-miR-590-3p)。

1.2.2 LINC00161、miR-590-3p表达检测

检测方法为qRT-PCR。提取癌组织、癌旁组织及各组宫颈癌SiHa细胞总RNA。反应体系25 μl; 反应条件：95 ℃预变性60 s, 95 ℃变性60 s, 56 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 共35次循环。LINC00161上游引物5'-GCCAAGGAACACCAAAGATTG-3',下游引物5'-AAGTCCAAGATGAAGGTGCC-3';GAPDH上游引物5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3',下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3';miR-590-3p上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGGAGCTTATTCATAA-3',下游引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3';U6上游引物5'CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3',下游引物5'-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'。LINC00161、miR-590-3p相对表达量以2-ΔΔCt公式计算。

1.2.3 细胞增殖活性检测

采用MTT法检测细胞增殖活性。将各组宫颈癌SiHa细胞接种于96孔板，加入MTT溶液(20 μl/孔)与DMSO(150 μl/孔),分光光度计下检测各孔490 nm吸光度值(OD值),计算各组细胞增殖活性。

1.2.4 细胞周期检测

取对数生长期宫颈癌SiHa细胞，加入预冷PBS洗涤，加入适量PI染色液后4 ℃孵育30 min, 应用流式细胞仪检测细胞周期(G0～G1、S、G2～M)。

1.2.5 划痕实验

将各组宫颈癌SiHa细胞悬液接种于6孔板(200 μl/孔),在培养板底部沿着水平方向画平行线，继续培养48 h后观察划痕处细胞生长状况，测量划痕宽度。划痕愈合率(%)=(划痕宽度0 h-划痕宽度48 h)/划痕宽度0 h×100%。

1.2.6 细胞侵袭检测

采用Transwell小室实验检测细胞侵袭数目。将各组细胞接种于铺满Matrigel基质胶稀释液的Transwell小室的上室，在下室中加含血清的培养液后培养8 h, 多聚甲醛固定后采用1%结晶紫染色液染色。置于倒置显微镜下观察并选择5个视野，计算细胞侵袭数。

1.2.7 LINC00161和miR-590-3p的靶向关系检测

设计合成WT-LINC00161(LINC00161的野生型载体)与MUT-LINC0016(LINC00161的突变型载体)。将miR-NC、miR-590-3p mimics分别与WT-LINC00161、MUT-LINC00161共转染至宫颈癌SiHa细胞，采用双荧光素酶报告基因实验检测各组相对荧光素酶活性。

1.2.8 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达检测

采用Western blot检测Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达。提取各组细胞总蛋白，纯化并定量其浓度，加入上样缓冲液后加入Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白样品进行SDS-PAGE,加入Ki67、E-cadherin、N-cadherin一抗后孵育，加入二抗后电泳并拍照。选择GAPDH为内参，计算Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SigmaPlot 12.5统计软件进行数据分析及统计。计量资料以表示，两组间均数对比采用t检验，多组间对比采用单因素方差分析(组间对比采用SNK-q检验),P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结 果

2.1 宫颈癌患者及宫颈癌SiHa细胞中LINC00161和miR-590-3p表达比较

宫颈癌患者肿瘤组织中LINC00161的相对表达量高于癌旁组织，而miR-590-3p的相对表达量低于癌旁组织，差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

si-NC组宫颈癌SiHa细胞LINC00161和miR-590-3p相对表达量分别为(0.96±0.04)和(0.95±0.03),si-LINC00161组宫颈癌SiHa细胞LINC00161和miR-590-3p相对表达量分别为(0.32±0.01)和(3.70±0.06),si-LINC00161+anti-miR-NC组宫颈癌SiHa细胞LINC00161和miR-590-3p相对表达量分别为(0.33±0.02)和(3.69±0.07),si-LINC00161+anti-miR-590-3p组宫颈癌SiHa细胞LINC00161和miR-590-3p相对表达量分别为(0.82±0.03)和(1.58±0.04)。4组宫颈癌SiHa细胞LINC00161和miR-590-3p相对表达量比较差异均有统计学意义(F=438.767,2 219.418,均P<0.05)。si-LINC00161组宫颈癌SiHa细胞LINC00161相对表达量水平低于si-NC组，miR-590-3p相对表达量高于si-NC组；si-LINC00161+anti-miR-590-3p组LINC00161相对表达量高于si-LINC00161+ anti-miR-NC组，miR-590-3p的相对表达量低于si-LINC00161+ anti-miR-NC组。

表1 宫颈癌患者肿瘤组织及癌旁组织LINC00161和miR-590-3p表达比较

2.2 各组宫颈癌SiHa细胞活性比较

si-NC组OD值为(1.05±0.08),si-LINC00161组OD值为(0.45±0.02),si-LINC00161+anti-miR-NC组OD值为(0.45±0.02),si-LINC00161+anti-miR-590-3p组OD值为(0.87±0.05),差异有统计学意义(F=113.938,P<0.05)。si-LINC00161组宫颈癌SiHa细胞OD值低于si-NC组，si-LINC00161+ anti-miR-590-3p组OD值高于si-LINC00161+anti-miR-NC组。见图1。

图1 宫颈癌SiHa细胞活性   

2.3 各组宫颈癌SiHa细胞周期比较

与si-NC组宫颈癌SiHa细胞比较，si-LINC00161组宫颈癌SiHa细胞G0～G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低；与si-LINC00161+anti-miR-NC组比较，si-LINC00161+anti-miR-590-3p组S期细胞比例升高，G0～G1期细胞比例降低。见表2。

表2 各组宫颈癌SiHa细胞周期比较

2.4 各组宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭情况比较

si-NC组宫颈癌SiHa细胞划痕愈合率为(56.73±1.19)%,侵袭细胞数为(189.33±4.50)个；si-LINC00161组宫颈癌SiHa细胞划痕愈合率为(30.79±0.59)%,侵袭细胞数为(76.67±1.70)个；si-LINC00161+anti-miR-NC组宫颈癌SiHa细胞划痕愈合率为(30.65±0.57)%,侵袭细胞数为(76.67±2.05)个；si-LINC00161+anti-miR-590-3p组宫颈癌SiHa细胞划痕愈合率为(49.75±1.08)%,侵袭细胞数为(158.33±3.30)个。4组宫颈癌SiHa细胞划痕愈合率和侵袭细胞数比较差异均有统计学意义(F=653.074,1 037.920,均P<0.05)。与si-NC组宫颈癌SiHa细胞比较，si-LINC00161组划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少；与si-LINC00161+anti-miR-NC组比较，si-LINC00161+anti-miR-590-3p组划痕愈合率升高，侵袭细胞数增多。见图2、图3。

图2 各组宫颈癌SiHa细胞划痕实验结果   

2.5 各组宫颈癌SiHa细胞中蛋白表达比较

与si-NC组宫颈癌SiHa细胞比较，si-LINC00161组宫颈癌SiHa细胞E-cadherin相对蛋白表达量升高，Ki67、N-cadherin相对蛋白表达量降低；与si-LINC00161+anti-miR-NC组宫颈癌SiHa细胞比较，si-LINC00161+anti-miR-590-3p组宫颈癌SiHa细胞E-cadherin相对蛋白表达量降低，Ki67、N-cadherin相对蛋白表达量升高。见图4、表3。

2.6 LINC00161和miR-590-3p靶向关系的检测

LINC00161与miR-590-3p存在互补序列。转染miR-NC的WT-LINC00161荧光素酶活性为(0.95±0.05),MUT-LINC00161荧光素酶活性为(0.97±0.05);转染miR-590-3p mimics的WT-LINC00161荧光素酶活性为(0.31±0.02),MUT-LINC00161荧光素酶活性为(0.93±0.04)。与转染miR-NC比较，转染miR-590-3p mimics可降低WT-LINC00161荧光素酶活性(t=20.585,P<0.05),而转染miR-590-3p mimics对MUT-LINC00161荧光素酶活性无明显影响(t=1.082,P>0.05)。LINC00161靶向miR-590-3p见图5。

图3 各组宫颈癌SiHa细胞侵袭情况  

图4 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达   

表3 各组宫颈癌SiHa细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量比较

图5 LINC00161靶向miR-590-3p   

3、讨 论

LINC00161在卵巢癌细胞中表达水平升高，并可与miR-128相互作用从而调控卵巢癌细胞耐药性[9]。LINC00161在骨肉瘤细胞中呈高表达，并可通过调节miR-645-IFIT2轴从而调控细胞增殖及凋亡[10]。鼻咽癌患者肿瘤组织中LINC00161表达水平显著高于正常鼻咽组织，其表达水平与患者的分期及预后等相关[11]。本研究发现：肿瘤组织中LINC00161表达水平升高，干扰LINC00161表达可降低OD值，诱导细胞周期停滞于G0～G1期，并可降低Ki67蛋白水平。研究表明：Ki67表达量升高与细胞周期密切相关，并可促进细胞增殖[12]。本研究结果表明抑制LINC00161表达后宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力显著下降，诱导细胞周期阻滞于G0～G1期。

本研究通过在线分子生物学软件证实LINC00161可靶向结合miR-590-3p。研究[13]表明：LncRNA FAM225A通过充当miR-590-3p的竞争内源性RNA而上调ITGB3进而促进鼻咽癌的发生和转移。miR-590-3p通过靶向转录因子3抑制乳腺癌细胞增殖并促进凋亡[14]。miR-590-3p是一种新型的microRNA,可通过靶向SOX9抑制骨肉瘤的进展[15]。此外，研究[16,17,18]发现miR-590-3p在多种肿瘤的发病机制、病情及预后评估中具有重要价值。本研究结果显示：宫颈癌患者肿瘤组织中miR-590-3p表达水平显著低于癌旁组织，提示LINC00161可充当miR-590-3p的竞争内源性RNA而发挥促癌作用。抑制miR-590-3p表达后可明显逆转干扰LINC00161表达对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。

综上所述，LINC00161在宫颈癌中表达显著增加而miR-590-3p表达显著降低，干扰LINC00161表达可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭，其机制可能与上调miR-590-3p表达有关。

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文章来源:杨媛媛.LINC00161负调控miR-590-3p对宫颈癌细胞生物学行为的影响[J].中国妇幼保健,2023,38(24):4913-4917.