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免疫组化和癌症基因组图谱数据分析SOD1在宫颈癌中的表达

2023-12-20 161 上传者：管理员

摘要：目的研究超氧化物歧化酶1(SOD1)在宫颈癌中的表达，并探讨其与宫颈癌患者预后的关系。方法选择新疆医科大学附属肿瘤医院2016年11月至2019年8月手术切除标本共150例，包括宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)和正常宫颈组织各50例。应用免疫组化检测SOD1在各组织中的表达，借助R2生物信息平台挖掘宫颈癌中SOD1的mRNA表达及与预后的关系。结果 SOD1在宫颈鳞癌中表达最高、CIN次之、正常宫颈组织中最低，差异有统计学意义(76%vs 52%vs 32%,χ2=19.50,P<0.05);在正常宫颈组织、CIN与宫颈鳞癌组织中，随着宫颈病变级别的升高，SOD1胞核阳性表达率逐渐升高，其差异具有统计学意义(χ2=6.850,P<0.05);在宫颈癌组织的胞核中表达量显著升高，并与组织浸润有关(χ2=10.424,P<0.05);对R2生物信息平台数据的挖掘和分析结果显示，SOD1 mRNA在宫颈癌所有临床分期中均有表达；Kaplan-Meier生存分析提示，SOD1高表达组患者有更好的预后(χ2=5.18,P<0.05);SOD1在不同组织学类型宫颈癌中的表达差异具有统计学意义(F=4.84,P<0.05)。结论 SOD1在浸润深的宫颈癌中表达升高，且与组织学类型有关，SOD1在宫颈癌胞核的高表达与不良预后相关。

关键词：
免疫组化
宫颈癌
数据挖掘
超氧化物歧化酶1
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宫颈癌(cervical cancer, CC)是威胁女性死亡的主要原因之一，2020年全球约有60万例新发病例和34万例死亡[1],是仅次于乳腺癌、结直肠癌、肺癌的第四常见肿瘤[2]。中国是宫颈癌发病率和死亡率最高的国家之一[3]。宫颈癌的一个重要临床病理特点是常伴有慢性炎症。微环境中持续存在的炎性刺激和缺氧致使活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)显著增多，局部代谢异常。为抵抗过量的ROS,癌细胞内的抗氧化系统也相应增强，此时抗氧化途径的激活被认为是癌症发生过程的一个关键事件[4]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SOD)是一种催化超氧化物自由基脱位为过氧化氢和分子氧的抗氧化酶。SOD1(Cu/Zn-SOD)作为其中的一种异构体，主要分布在细胞内，是一种内源性蛋白[5]。SOD1作为一种抗氧化剂，除与衰老相关的氧化应激有关外[6],还在调节细胞、保护基因组DNA稳定方面发挥重要的作用[7]。由于SOD1能够清除自由基，通常被认为其具有抑癌作用。深入研究发现，随着癌细胞内的ROS浓度升高，其引起的氧化应激反应随之上调，在肺肿瘤、乳腺肿瘤和鼻咽癌中均观察到SOD1表达升高[8,9,10,11]。本次研究旨在探讨SOD1在宫颈癌中的表达及其临床意义。

1、资料与方法

1.1一般资料

选择新疆医科大学附属肿瘤医院2016年11月至2019年8月手术切除标本共150例，包括宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN) II-III和正常宫颈组织各50例。纳入标准：宫颈鳞癌均经病理确诊；无严重并发症；有完整的病理资料。所有研究对象均知情同意自愿参与研究。收集标本相关的临床病理信息，包括年龄、临床分期、肿瘤直径、病理分级、浸润深度、淋巴结转移等。临床分期根据国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)的标准确定。

1.2免疫组化

应用免疫组化(immunohistochemistry, IHC)检测SOD1在宫颈组织中的表达。按照免疫组化的常规操作进行，即准备好2μm厚的石蜡宫颈组织切片，脱蜡水化，抗原修复后滴加抗SOD1兔单克隆抗体(Priteintech, 22206-1-AP) 4℃过夜，然后二抗室温孵育(羊抗兔IgG,中国北京中杉金桥公司)30分钟，3,3'-二氨基联苯胺(3,3N-Diaminobenzidine, DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。SOD1染色由两名新疆医科大学病理教研室的专家审阅评价。SOD1结果用Image Pro Plus6.0软件进行量化分析。

1.3 TCGA数据库分析

本研究借助R2生物信息平台(http: //hgser-ver1.amc.nl/cgi-bin/R2/main.cgi)对TCGA-305-rsem-tcgars数据集宫颈鳞癌组织样本中SOD1 mRNA的表达进行了数据挖掘，并分析KIM数据库中300例宫颈癌(包括宫颈鳞癌、腺癌和腺鳞癌)样本中SOD1 mRNA的表达水平与组织学类型的关系。

1.4统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料用例数(n)和百分比(%)表示，组间比较采用卡方检验或方差分析。Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析SOD1表达与生存的关系。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 SOD1在宫颈组织中的定位和表达

免疫组化结果显示，50例宫颈鳞癌中，38例(76%)SOD1表达阳性；50例CIN中，26例(52%)SOD1表达阳性；50例正常组织中，16例(32%)SOD1表达阳性。SOD1在宫颈鳞癌中表达最高、CIN次之、正常组织中最低，差异有统计学意义(χ2=19.50,P<0.05)。正常宫颈组织中SOD1均在胞浆中表达；CIN组织中，单纯胞浆表达12例，单纯胞核表达8例，胞浆和胞核均表达6例；宫颈鳞癌组织中，单纯胞浆表达7例，单纯胞核表达23例，胞浆和胞核均表达8例，见图1。在正常宫颈组织、CIN与宫颈鳞癌组织中，随着宫颈病变级别的升高，SOD1胞核阳性表达率逐渐升高，其差异具有统计学意义(χ2=6.850,P<0.05)。

2.2宫颈鳞癌组织SOD1表达与临床病理参数的关系

在宫颈鳞癌中，SOD1的表达与组织浸润有关，其阳性表达组的宫颈癌浸润深度明显高于阴性表达组，差异具有统计学意义(χ2=10.424,P=0.001);SOD1的表达与病理学分级、肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期均无关(P>0.05),见表1。

图1 免疫组化检测SOD1在宫颈病变组织及正常组织中的表达

表1 宫颈鳞癌组织SOD1表达与临床病理参数的关系 [n(%)]

2.3 R2生物信息平台中SOD1表达分析

借助R2生物信息平台对TCGA-305-rsem-tcgars数据集宫颈鳞癌组织样本中SOD1 mRNA的表达进行了数据挖掘和分析，结果显示，SOD1 mRNA在宫颈癌所有临床分期中均表达，见图2。Kaplan-Meier生存分析提示，SOD1高表达组患者(120例)较SOD1低表达组(172例)具有更好的预后(χ2=5.18,P=0.023),见图3。对KIM-300-custom-ilmnht12v4数据集中宫颈癌组织样本SOD1 mRNA的表达情况进行分析，结果显示，SOD1在不同组织学类型宫颈癌中的表达差异具有统计学意义(F=4.84,P=0.009),见图4。

图2 SOD1 mRNA在305例宫颈鳞癌中的表达

图3 292例宫颈鳞癌中SOD1表达与生存的关系

图4 300例宫颈癌中SOD1表达与组织学类型的关系

3、讨论

3.1病理状态下SOD异常表达的生物学意义

SOD作为抗氧化系统的重要代表，其表达升高是慢性炎症持续刺激的必然结果。慢性炎症导致单核巨噬细胞系统的激活，产生高水平的ROS[12],ROS水平急剧增加至有毒浓度，氧化应激将造成不可逆的损伤[13]。此时，为抵抗过量的ROS,体内的抗氧化酶SOD表达上升。氧化应激和慢性炎症过程是紧密耦合的，如果不能阻止这些过程，可能会导致驱动癌变[14]。众所周知，宫颈癌与人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)持续感染密切相关，是慢性炎症相关癌症的典型代表。与正常细胞相比，癌细胞通常含有更高水平的ROS和抗氧化酶，特别是在晚期，癌细胞非常依赖高活性的抗氧化系统来维持快速增殖和存活[15]。人体中有三种SOD同工酶：SOD1提供了80%的总细胞SOD活性[16],在调节氧化应激反应中作为转录因子，可防止细胞过度损伤和凋亡[17];SOD2在不同类型的肿瘤中具有致癌和抑癌的双向作用[18];SOD3作为主要的ROS防御因子，在对胰腺导管癌的研究中发现其表达量降低与不良预后密切相关[19]。

本研究中，我们借助R2生物信息平台对TCGA-305-rsem-tcgars数据集305例宫颈鳞癌组织样本中的SOD1 mRNA表达进行了数据挖掘和分析，结果显示，SOD1高表达组患者的预后较好。同时对KIM-300-custom-ilmnht12v4数据集300例宫颈癌组织样本中的SOD1 mRNA表达分析提示，SOD1在宫颈腺鳞癌的表达高于其在鳞癌、腺癌中的表达，提示SOD1表达与宫颈癌的不同组织学类型相关。可见SOD在肿瘤发生发展中的生物学行为非常复杂，值得深入探讨。

3.2宫颈癌中SOD1表达及其细胞定位的分析和意义

在本研究中，我们检测并分析了SOD1蛋白在宫颈病变内的表达，结果显示在正常宫颈组织、癌前病变、宫颈鳞癌中，随着宫颈病变级别的升高，SOD1的表达逐渐升高。有证据表明，SOD1是一种致癌基因，在体内促进癌细胞增殖，加速肿瘤发展，并在人类许多癌症中过表达。Li[20]等研究显示，SOD1在鼻咽癌中的表达显著增加，且高表达患者的生存时间较短。Gomez等[9]研究发现，SOD1对癌基因介导的乳腺癌细胞增殖至关重要，且增殖的特异性与癌细胞中超氧化物的升高相关，但在正常细胞中并没有观察到这些。此外，在所有分子亚型的乳腺癌内，SOD1表达升高与较低的生存率和转移增加密切相关。另有研究发现，SOD1也在多发性骨髓瘤中表达，其作用发生在疾病进展的较晚阶段，表明SOD1的表达增加提示着不良预后[21]。然而，本研究生物信息学分析表明SOD1高表达组的宫颈癌患者预后较好，与我们的实验结论及以上文献报道不一致，对此我们分析如下：生物信息学分析的结果是基于SOD1 mRNA的表达数据，我们的实验结果是基于免疫组化SOD1的蛋白表达数据，SOD1转录水平和翻译水平表达意义的不一致可能反映出SOD1存在翻译后调控或修饰。酶活性发挥的整体机制复杂，仅在转录或者翻译水平并不能推断酶最后的活性，此过程涉及翻译后修饰，细胞定位及与其他蛋白之间的互作。但这还需要我们进一步研究来佐证[22]。

SOD1作为转录因子参与到癌症进程中[23]。在HeLa细胞中，SOD1已被证明与癌基因和抑癌基因的启动子结合，通过下调抑癌基因、上调致癌基因促进肿瘤的发生。此外，SOD1除了抗氧化酶的作用外，还作为一种响应H2O2的调控蛋白，在许多哺乳动物基因的表达中发挥作用[24]。研究表明在应对高水平H2O2(0.4mM)的氧化应激时，SOD1会转移到细胞核，从而通过转录上调抗氧化基因的表达[17]。文献报道，核SOD1蛋白表达在多种人体组织中，尤其在睾丸、小脑、乳房、皮肤真皮层中表达丰富[23],并在乳腺癌和肺癌的细胞核中不断富集[4,9]。这支持了本研究中免疫组化染色实验结果，SOD1除在正常宫颈组织的胞浆内表达外，还表达于基底细胞胞核内。在正常宫颈组织逐渐进展为宫颈癌的过程中，SOD1在胞浆的表达逐渐减少，而在胞核的表达量逐渐增高。SOD1的表达与宫颈癌临床病理参数关系的分析结果显示，SOD1在胞核的表达与组织浸润有关。在对KRAS驱动的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的研究中报道，SOD1定位于细胞核，通过与PeBoW蛋白相互作用，在癌细胞增殖中起着重要的作用，并与NSCLC肿瘤的预后相关[4],这与本研究结果一致。

综上所述，在宫颈癌的发生、发展进程中，SOD1的异常表达与宫颈癌的浸润深度、组织学类型有关，宫颈癌中SOD1胞核表达量的增高对宫颈癌患者的预后具有一定的参考价值，开发其抑制剂用于联合抗肿瘤治疗具有潜在的可能性。

参考文献:

[7]陈长凤,谭俊,邵雷,等.Sod1抑制剂与癌症[J].工业微生物,2016,46(2):56-59.

[18]易力,刘宏雷.超氧化物歧化酶2与肿瘤关系的研究进展[J].山东医药,2021,61(29):109-112.

[22]贾海红,李冰清.超氧化物歧化酶翻译后修饰的研究进展[J].生物技术通报,2022,38(2):237-244.

基金资助:国家自然科学基金项目(81660427);

文章来源:林冰洁,王齐心,聂晓菁等.基于免疫组化和癌症基因组图谱数据分析SOD1在宫颈癌中的表达[J].中国妇幼健康研究,2023,34(12):78-83.