肝硬化是肝脏长期由一种或多种病因引起的肝损伤,在炎症因子长期刺激下,肝脏生理结构和功能发生病理性改变,是临床上常见的慢性肝病,具有高发病率和高死亡率的特点｡肝硬化是人类健康的主要负担,常见于慢性肝病的终末期,易引起消化道出血､继发感染､肝癌及肝性脑病等多种并发症,全球每年约有200万例死于肝硬化及其并发症[1-2]｡有研究表明,肝硬化可使肠组织处于缺血缺氧状态,引发肠组织发生坏死,细菌位移,导致肠黏膜屏障受损｡同时,肝硬化将引起机体产生大量一氧化碳和肠道菌群发生位移,肠系膜血管系统受到影响,使肠黏膜受损,降低机体免疫功能,促使病情加重,提示肝硬化与肠黏膜屏障受损密切相关[3]｡肠上皮屏障在肠道维持机体健康方面起着重要作用,肠黏膜长期受损将释放大量有害物质和内毒素,持续激活肝脏Kupffer细胞,使之释放大量炎症因子和细胞因子,并产生大量脂质代谢产物,引起全身出现非特异性炎症反应,严重时还会破坏远端器官的生理功能,甚至引起多器官功能障碍综合征,最终造成机体死亡[4]｡肠黏膜在防御肠道细菌位移和有害物质入侵中发挥重要作用,故肠黏膜屏障功能对肝硬化预后及其并发症的预防具有重要意义｡

炎症是肝硬化发展的主要因素,包括白细胞介素(IL)-1β､IL-6､肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等在内的许多炎症因子能够激活肠道黏膜下的细胞,进而又释放大量炎症因子,在一系列生理､病理变化下,促进肝硬化进程[5]｡Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NFκB)信号通路在炎症调节中发挥重要作用,其中,TLR4是一种天然免疫识别受体,启动信号传导途径,激活NF-κB,促使NF-κB下游炎症介质TNF-α､IL-6､IL-17等被释放[6]｡TLR4被认为是肠黏膜屏障与肝硬化的关键接口,当肝硬化发生时,体内稳定状态被破坏,肠道菌群紊乱,出现菌群失调,进而导致肠黏膜生物屏障功能异常,而恢复肠黏膜屏障功能可促进机体内环境稳定,从而减轻肝损伤[7]｡因此,减轻炎症反应,阻断TLR4/NF-κB信号通路,是保护肠黏膜屏障的重点[8]｡

目前,西医治疗主要为补充肠道内益生菌,但治疗效果不佳且复发率比较高｡传统医药在抑制肝硬化进展方面有着“多成分-多靶点-多途径”的作用特点,具备独特的临床疗效｡大黄素是一种蒽醌类化合物,具有抗炎､抗肿瘤､镇痛和器官保护等药理作用,常用于肝炎､肺炎､心脑血管及肿瘤等疾病的治疗[9]｡潘广涛等[10]发现,大黄素通过降低丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平及下调Caspase-3､Bcl-2和p53蛋白表达,调节氧化应激和减轻肝细胞凋亡途径,从而对脂多糖诱导的急性肝损伤起到保护作用｡大黄素能够减轻四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化小鼠肝组织中白细胞和巨噬细胞的浸润及纤维增生,从而减轻小鼠肝脏炎症,猜测与降低肝脏内转化生长因子(TGF)-β1和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1水平及减少单核巨噬细胞的浸润有关[11]｡此外,LIU等[12]认为,大黄素作为P2X7受体拮抗剂是基于其具有抗炎和免疫抑制活性的特点｡目前,大黄素对肝硬化及肠黏膜屏障治疗作用及其相关的分子机制鲜见报道｡因此,本研究以CCl4复制肝硬化大鼠模型,探究大黄素对肝硬化大鼠肝功能及肠黏膜屏障损伤的改善作用及作用机制,为大黄素在肝硬化治疗中的应用提供实验依据｡

1、材料与方法

1.1仪器与试剂E-203-L显微镜(江苏海门远泰生物公司)､Spark型酶标仪(瑞士Tecan公司)､AmershamImager680化学发光仪(美国GE公司)｡大黄饮片(批号为181109)购自南通三越中药饮片有限公司;CCl4､乙醇､乙酸乙酯(批号分别为20221119､20220507､20220727)购自天津致远化学试剂有限公司;苏木素-伊红试剂盒(批号分别为20220104､20220108)购自武汉塞维尔生物科技有限公司;IL-6､TNF-α､IL-17､酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号均为202303)均购自上海酶联生物科技有限公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)､天门冬氨酸氨基转移酶(AST)､总胆红素(TBIL)､BCA蛋白检测试剂盒(批号分别为20230318､20230318､20230318､20230421)均购自北京索莱宝科技有限公司;α-羟基丙酸(αLA)､二胺氧化酶(DAO)和血浆内毒素(ET)试剂盒(批号分别为20230411､20230413､20230430)均购自上海碧云天生物技术有限公司;TLR4抗体､NF-κBp65抗体､β-actin一抗､羊抗兔二抗(货号分别为ab217274､ab288751､ab179467､ab150077)均购自美国Abcam公司｡

1.2方法

1.2.1分组及模型从36只SD大鼠(辽宁长生生物技术股份有限公司)中随机分为正常组､模型组和大黄素组,每组12只,除正常组外,其余组大鼠按2mL/kg腹腔注射50%CCl4-玉米油溶液诱导肝硬化模型,每周2次,一共12周｡第9周开始,将肝硬化模型大鼠随机分为模型组和大黄素组(200mg/kg),每组12只,造模同时,模型组和大黄素组分别给予相应体积的生理盐水及大黄素溶液,每日1次,一共4周｡

1.2.2大黄素提取将大黄饮片粉碎后加入适量95%乙醇溶液超声萃取3次,每次1h,将提取液合并浓缩,浓缩液用水-乙酸乙酯萃取,即得到大黄素提取物｡大黄素提取物用适量乙醇溶解后加入生理盐水稀释至浓度为100mg/mL｡

1.2.3标本采集取材前1天禁食不禁水,实验中用20%乌拉坦溶液麻醉大鼠,观察大鼠刺激无反应后,固定大鼠,以75%乙醇擦拭腹部后剪开腹壁,清洁腔内余血,找到腹主动脉取血,并取出新鲜肝组织及肠组织｡血液静置2h,离心,取上清液,于冰箱保存备用｡肝脏和回肠在4℃预冷生理盐水中漂洗2~3遍清除血液,滤纸吸干后取肝脏和回肠同一部位,用4%多聚甲醛溶液固定,余下组织样品迅速冻于液氮,置于-80℃冰箱保存备用｡

1.2.4肝组织､肠组织病理形态学4%多聚甲醛固定肝组织､肠组织24h,自动脱水机脱水,石蜡包埋,制成4μm厚的病理切片后,进行HE､SirusRed染色,显微镜下观察肝组织､肠组织病理学变化情况｡

1.2.5肝功能､炎症因子､肠黏膜屏障功能指标测定通过ELISA测定血清中AST､ALT､TBIL､αLA､DAO､ET水平及肠组织中IL-6､TNF-α､IL-17水平,相关试剂盒于室温平衡30min,严格按照说明书步骤进行操作,检测相应指标水平｡

1.2.6蛋白印迹法检测大鼠回肠组织中TLR4､NFκB蛋白表达取适量肠组织加入RIPA研磨,4℃7500r/min离心10min,得到总蛋白,蛋白浓度用BCA检测｡电泳分离后,进行转膜,5%牛奶摇床封闭1h,TBST洗涤,加入合适浓度的TLR4､NF-κB一抗,4℃孵育过夜,次日用TBST洗涤5min,加入羊抗兔二抗,室温孵育1h,TBST快速漂洗,膜上加发光液,然后进行曝光,lmageJ软件分析蛋白质条带,计算蛋白相对表达水平｡

1.3统计学处理

采用SPSS21.0软件对实验数据进行统计学分析｡计量资料以x±s表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t或DunnettT3检验｡P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1大鼠日常情况正常组大鼠日常状态良好,体重增长稳定,毛发光洁;模型组大鼠体重增长缓慢､食欲下降､粪便稀淌且毛发粗糙无光泽;与模型组比较,大黄素组大鼠体重增长略快,毛发光泽有所改善｡

2.2大黄素对大鼠肝组织､回肠组织HE染色病理组织学影响正常组大鼠肝内由健康的肝小叶构成,肝索排列有序､以中央静脉为中心,向周围散开呈放射形状,并且肝细胞未见坏死等异常表现;模型组大鼠肝细胞破裂､坏死且排列紊乱､大面积炎症因子浸润､脂肪变性及大面积纤维组织增生,并形成纤维间隔;大黄素组大鼠肝细胞排列较为整齐､炎症因子及纤维蛋白增生明显减少｡见图1｡回肠组织HE染色结果显示,正常组大鼠回肠组织绒毛排列整齐有序､固有层无水肿现象､组织黏膜完整结构无异常表现;模型组大鼠回肠组织有大面积炎症因子浸润､绒毛萎缩并断裂､间质水肿､病理结构明显;大黄素组大鼠回肠组织结构较完整､炎症因子浸润明显减轻､绒毛断裂､脱落情况明显得到改善｡见图2｡

图2大黄素对大鼠回肠组织的HE染色(×400)

2.3大黄素对大鼠肝组织SirusRed染色病理形态图1大黄素对大鼠肝组织的HE染色(×100)

的影响SirusRed染色结果显示,正常组大鼠肝组织仅存在少许散在的纤维;与正常组大鼠比较,模型组大鼠肝组织存在大面积红色胶原纤维,纵横交错;与模型组大鼠比较,大黄素组大鼠肝组织中可见纤维明显减少｡见图3｡

图3大黄素对大鼠肝组织的SirusRed染色(×400)

2.4大黄素对大鼠肝功能的影响与正常组大鼠比较,模型组大鼠血清中AST､ALT､TBIL水平均升(P<0.001);大黄素组大鼠AST､ALT､TBIL水平相较模型组大鼠降低(P<0.01)｡见表1｡

表1大黄素对大鼠AST､ALT､TBIL水平的影响(x±s,n=6,U/L)

2.5大黄素对大鼠炎症因子的影响模型组大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL-17水平相较正常组大鼠均升高(P<0.001);大黄素组大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL17水平相较模型组大鼠降低(P<0.001)｡见表2｡

表2大黄素对大鼠IL-6､TNF-α､IL-17水平的影响(x±s,n=6,pg/mL)

2.6大黄素对大鼠肠黏膜屏障功能指标的影响模型组大鼠回肠组织中α-LA､DAO和ET水平相较正常组大鼠均升高(P<0.001);大黄素组大鼠回肠组织中α-LA､DAO和ET水平相较模型组大鼠降低(P<0.01)｡见表3｡

表3大黄素对大鼠α-LA､DAO､ET水平的影响(x±s,n=6)

2.7大黄素对大鼠回肠组织中TLR4､NF-κB蛋白表达的影响模型组大鼠回肠组织中TLR4､NF-κB蛋白水平与正常组比较明显升高(P<0.01);与模型组大鼠比较,大黄素组大鼠回肠组织中TLR4､NF-κB蛋白水平均降低(P<0.05)｡见图4｡

图4大黄素对大鼠回肠组织中TLR4､NF-κB蛋白表达的影响

3、讨论

肝硬化在中医中属于“气虚血瘀”范畴,主要是由肝脾受损､气血瘀阻､肝络瘀阻所致,引起胃肠道内有毒物质堆积,导致肠黏膜屏障受损,机体免疫力下降,中医对肝硬化治疗基本原则为辩证施治,以活血利水､柔肝健脾为主｡肝硬化患者易出现肠道菌群失衡,增加肠源性ET血症的风险,大量炎症因子被释放,反复刺激肝脏,使肝细胞受损,加速病情发展[13]｡大黄素是中药大黄的主要有效成分,具有抗肿瘤､抗炎和抗氧化作用｡本研究用CCl4复制肝硬化模型,经HE､SirusRed染色,经肝组织形态学观察发现典型肝硬化及肠黏膜屏障受损症状｡经大黄素治疗后,大鼠肝细胞清晰､纤维组织增生明显减少及胶原纤维表达量降低,并发现回肠组织中结构较完整､炎症因子浸润明显减轻､绒毛断裂和脱落情况均有所恢复,表明大黄素能够促进肝细胞及肠黏膜细胞的修复和再生,从而改善肝组织损伤及回肠吸收能力｡

AST､ALT和TBIL是肝细胞受损的重要指标,当肝脏受到损伤时,肝功能指标AST､ALT和TBIL被释放进入血液导致其水平上升[14]｡本研究发现,CCl4诱导的肝硬化大鼠血清中AST､ALT和TBIL水平升高,肝细胞坏死､纤维增生;经大黄素干预后,肝硬化大鼠血清中AST､ALT､TBIL水平均降低,猜测与大黄素具有显著的抗氧化性能和抗炎作用有关,大黄素能够清除体内氧自由基,减少氧化应激对肝细胞的损伤,有利于恢复肝细胞膜通透性并改善大鼠肝脏合成及分解功能,减少酶类的释放,进而改善大鼠肝功能｡

α-LA､DAO和ET是肠黏膜屏障功能受损的重要标志物,肠道通透性下降时,血清中α-LA､DAO和ET水平上升,微生物产物和炎症因子等物质通过肠道进入肝脏,引发炎症反应[15]｡本研究发现,肝硬化大鼠绒毛萎缩并断裂､间质水肿､病理结构明显,并且其大鼠血清中α-LA､DAO和ET水平升高,说明肠黏膜屏障受损,肠道通透性增加,促使肠道内革兰阴性菌释放的ET和肠道内细菌繁殖发酵而产生的α-LA进入血液循环｡大黄素干预后,大鼠血清中α-LA､DAO和ET水平降低,猜测与大黄素的抗炎作用有关,通过抑制炎症因子的活性,减轻肠黏膜炎症反应,保护肠黏膜屏障的完整性,减少对肠黏膜细胞的损伤,促进细胞的修复和再生过程,从而促进肠黏膜屏障的完整性和功能,减轻肠道通透性,防止有害物质进入体内｡有研究表明,大黄素能够调节肠道菌群的平衡,促进有益菌的生长,抑制有害菌的繁殖,这种调节作用有助于恢复肠道菌群的正常功能,从而保护肠黏膜屏障[16]｡本研究结果表明,大黄素通过改善肠道通透性减轻肝硬化大鼠ET在肝脏所引发的炎症反应,并减轻肠道病理损伤,进而对肠黏膜屏障功能发挥保护作用｡

TLR4/NF-κB信号通路在免疫炎症调节中具有重要作用,在肠黏膜屏障损伤中,TLR4可开启固有免疫应答,激活NF-κB信号转导通路,从而介导机体炎症介质释放,介导炎症反应,导致组织器官受到损伤,因此TLR4/NF-κB信号通路的激活情况可用来评价肠黏膜屏障受损程度[17]｡炎症损伤是众多病因引起肝损伤向肝硬化发展中不可或缺的中间环节,肝脏受到损伤后,Kupffer细胞将释放大量IL-6､TNF-α等炎症因子,引起肠道菌群及通透性发生改变[18]｡本研究发现,大黄素能够降低肝硬化大鼠回肠组织中IL6､TNF-α､IL-17水平及下调TLR4､NF-κB蛋白表达,进而减轻炎症反应,表明大黄素有可能通过TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症因子的释放和炎症细胞的浸润,减轻肝脏及肠道内的炎症反应,进而减轻肝硬化大鼠肠黏膜屏障功能的损伤并缓解肝硬化的进展｡

综上所述,大黄素可能可以改善肝功能､抑制炎症因子释放､减轻炎症反应,降低ET､DAO､α-LA水平,保护肠黏膜屏障,从而缓解肝硬化进程,其机制可能是与TLR4/NF-κB信号通路有关｡本研究为临床上肝硬化的治疗提供了参考依据｡

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基金资助:陕西省卫生健康委科研项目(WJ2022B0105);

文章来源:马琦阳,潘高展.大黄素对肝硬化大鼠肝功能及肠黏膜屏障损伤的改善作用[J].国际检验医学杂志,2025,46(08):960-964.