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过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的纯化及体外功能验证

2024-07-01 58 上传者：管理员

摘要：目的体外验证过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的功能，为在阿尔茨海默病模型动物的体内功能验证奠定基础。方法利用本课题组的专利结构，构建能定位于外泌体膜上的重组IL-3慢病毒载体，包装病毒感染293T细胞，筛选稳定表达细胞株。用流式细胞测量术和免疫荧光技术对IL-3的膜定位进行验证；超滤离心纯化IL-3外泌体，透射电镜观察外泌体形态；纳米流式测量术检测外泌体粒径分布及浓度；Western blot检测IL-3及外泌体相关标志蛋白质表达；免疫荧光技术检测其对小胶质细胞系BV-2吞噬Aβ淀粉样蛋白能力的影响。结果经过载体构建、病毒感染、嘌呤霉素筛选和验证，得到稳定过表达膜定位IL-3的293T细胞株；收集纯化外泌体，在透射电镜下可见直径50～100 nm的双层膜囊泡结构；免疫印迹结果显示CD63、ALIX、TSG101等多种外泌体标志蛋白质检测阳性，且与对照相比富含IL-3,提示IL-3外泌体纯化成功；免疫荧光技术检测结果显示IL-3外泌体能在体外促进BV-2细胞对Aβ淀粉样蛋白的吞噬作用。结论过表达膜定位IL-3的基因修饰293T细胞外泌体在体外兼具IL-3和外泌体的作用，能够促进小胶质细胞的吞噬作用，为阿尔茨海默病的临床治疗提供新的思路。

关键词：
AD
外泌体
小鼠脑小胶质细胞系(BV-2)
白细胞介素3(IL-3)
阿尔茨海默病
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阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种以进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病，是一项全球性的公共卫生问题，严重威胁人类的生命健康和生活质量。AD的病理机制较为复杂，目前公认的有β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)聚集、Tau蛋白的过度磷酸化及神经炎性反应等假说[1]。有研究表明，在AD模型小鼠中，星形胶质细胞分泌的白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)可促进小胶质细胞向Aβ迁移聚集，并且促进小胶质细胞对Aβ的吞噬作用，从而减少Aβ沉积，减缓AD的进展，因此IL-3有望成为AD的一个有效治疗药物[2]。但由于中枢神经系统存在血脑屏障这一特殊结构，使得外周给予的重组IL-3蛋白难以到达脑部组织，而直接立体定位注射给药又会带来较大的创伤。外泌体是细胞分泌的一种直径30～150 nm的能够参与细胞间信息调控的囊泡。研究显示，外泌体能通过血脑屏障，在神经系统疾病中具有巨大的应用潜力[3,4]。因此，本研究利用课题组前期工作获得的能将外源蛋白锚定表达在外泌体膜上的专利结构，构建纯化得到过表达膜定位IL-3的基因修饰293T细胞外泌体，并在体外细胞水平上初步验证其对小胶质细胞吞噬Aβ的促进作用，为进一步在阿尔茨海默病模型动物的体内功能验证奠定基础。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：

人胚肾上皮细胞系(HEK293T)、小鼠脑小胶质细胞系(BV-2)(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 试剂：

胎牛血清(Gibco公司)、DMEM培养基、DMEM/F12培养基(北京细工生物科技有限公司)。IL-3(Proteintech公司);CANX、CD63、CD9(CST公司);TSG101、ALIX、Sytenin(Abcam公司);HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物科技有限公司);流式抗体IL-3-PE(Biolegend公司);免疫荧光二抗anti-Rabbit 647(CST公司); ECL化学发光显影液、BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司); JetPRIME® Polyplus转染试剂(Polyplus公司);嘌呤霉素(Bioss公司)

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组：

将293T细胞用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；筛选得到的IL-3稳定转染细胞株(稳转株),培养同野生型293T,但培养基中会加入嘌呤霉素维持培养；BV-2细胞用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养，取对数生长期的细胞进行实验。体外功能实验分组：blank组、Aβ组(无治疗)、Aβ+WT-exo组(野生型293T来源的外泌体)、Aβ+IL3-exo组(IL-3稳转株来源的外泌体)、Aβ+rIL-3组(重组IL-3蛋白)。

1.2.2 稳转细胞株的构建：

通过双酶切分别获得设计合成的目标片段和带有嘌呤霉素筛选结构的慢病毒表达载体片段，经T4连接酶连接，得到目标重组质粒。将构建成功的慢病毒表达质粒(图1A)与包装质粒(psPAX2),包膜质粒(pMD2G)共转染至293T细胞，48 h后收集病毒上清，利用超滤离心方法浓缩病毒。用慢病毒浓缩液感染293T细胞，48 h后加入嘌呤霉素(20 mg/L)进行筛选获得稳定表达IL-3融合蛋白的多克隆细胞株。稳转株经流式细胞测量术检测IL-3阳性率，再利用免疫荧光技术观察IL-3在胞内的表达分布，后期稳转株维持培养在嘌呤霉素浓度为10 mg/L的培养基中，收集外泌体前停止添加药物。

1.2.3 外泌体的提取与纯化：

首先将细胞接种于经多聚鸟氨酸包被的细胞培养瓶中，待细胞增殖至70%～80%汇合度时，先使用DMEM/F12基础培养基洗涤3次，加入DMEM/F12基础培养基，收取培养24 h与48 h的细胞上清。将收集到的细胞上清于300×g、4 ℃离心20 min去掉细胞，再经0.22 μm滤器去除细胞碎片等杂质。加入100 ku的超滤管，3 000×g、4 ℃离心5～10 min(直至所有上清液离心完毕),再加入超滤管内留存滤液10倍体积的PBS缓冲液(预冷),3 000 ×g、4 ℃离心5～10 min(重复洗涤3次),最后收集超滤管中留存的液体即为收获的外泌体纯化液。

1.2.4 外泌体的表征鉴定：

将外泌体纯化液经1×PBS缓冲液稀释10倍后，送至中国医学科学院电镜室进行透射电镜拍摄，并送至北京国典医药公司使用纳米流式测量技术以检测其粒径分布及CD63+的外泌体比例。

1.2.5 流式细胞测量术：

取状态良好的稳转细胞株和野生型的293T细胞利用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，使用预冷的PBS洗涤2遍，加入1% BSA封闭5min, 离心弃掉多余封闭液，均加入IL3-PE抗体于4 ℃避光孵育30 min, 加入PBS洗涤2遍，最后加入100 μL PBS重悬，于Accuri C6 Plus上机检测稳转细胞株中表达IL-3的细胞比例。

1.2.6 Western blot检测蛋白质水平：

利用RIPA细胞裂解液(提前加入蛋白酶抑制剂)裂解细胞提取蛋白质，置于冰上裂解30 min, 之后进行超声(4 s/次，3次),最后于4 ℃离心12 000 r/min, 15 min, 吸取上清，同外泌体进行BCA蛋白质定量，之后将细胞蛋白质样本和外泌体样本加入上样缓冲液加热10 min制备电泳样本。之后经过SDS-PAGE分离转移至NC膜上，再用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h, 一抗1∶1 000稀释，于4 ℃孵育过夜，用TBST在摇床洗涤5次，每次5 min, 最后用山羊抗兔或山羊抗鼠二抗IgG(1∶5 000)孵育1 h, 摇床上使用TBST洗涤5次，每次5 min, 最后用ECL超敏发光显影液曝光蛋白质条带。

1.2.7 免疫荧光技术：

24孔板里提前铺上爬片，之后每孔铺5×104个BV-2细胞，待贴壁24 h后，分组进行预处理，加入终浓度为1 μmol/L的Aβ1-42-FAM溶液孵育，6 h后去掉细胞培养上清，使用PBS缓冲液洗涤2遍。于孔板里进行免疫荧光染色，每孔加入浓度为1%的多聚甲醛固定30 min, 先后经0.25% Triton-X100破膜，即用型正常山羊血清封闭 1h, 即用型正常山羊血清稀释的一抗室温孵育2 h, 荧光标记的二抗避光孵育1 h, PBS溶液稀释的DAPI染料作用10 min, 最后在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片从孔板里取出，将有细胞面倒扣在封片剂上。待晾干后，使用共聚焦显微镜观察荧光。

1.3 统计学分析

使用GraphPad prism 9 进行数据处理和统计学分析，采用单因素变量方差或t检验，计量资料以均数±标准差

表示。当P<0.05时，表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 IL-3重组慢病毒载体的构建和验证

将合成的IL-3质粒与本课题组保存的带有嘌呤霉素抗性的慢病毒表达空载体进行双酶切，得到了符合预期大小的片段(目标片段700 bp左右，载体片段10 kb左右)(图1B),连接后得到IL-3融合蛋白慢病毒表达载体。用重组慢病毒载体质粒瞬时转染293T细胞，48 h后收集外泌体与细胞，Western blot结果显示，经质粒转染的293T细胞中能检测到外源IL-3的表达(图1C),表明该质粒能顺利表达，而且外源IL-3能够在外泌体中富集。以上结果表明重组IL-3慢病毒载体构建成功，可以用于包装慢病毒，筛选稳定过表达IL-3的293T细胞。

2.2 稳定过表达IL-3的293T细胞的筛选与鉴定

用嘌呤霉素筛选72 h后，流式细胞测量术检测稳定转染细胞株表面IL-3的表达情况。结果显示，有61%的293T细胞表达跨膜的重组IL-3(图2A)。此外，免疫荧光结果也显示，这些IL-3大多数定位于细胞膜上(图2B)。上述结果表明，稳定过表达IL-3的293T细胞株构建成功。

2.3 过表达IL-3的293T细胞外泌体的表征鉴定

利用超滤离心方法提取纯化，获得稳定过表达IL-3的293T细胞外泌体。透射电镜下明显可见多个直径50～100 nm左右的具有双层膜结构的外泌体囊泡(图3A)。纳米流式检测结果显示，表达CD63的囊泡比例为30.4%(图3B),粒径分布在76 nm左右，符合外泌体的粒径分布范围(图3C)。Western blot的结果表明，稳定过表达IL-3的293T细胞及其外泌体均有重组IL-3的表达，且均能检测到外泌体四次跨膜蛋白CD9、CD63及外泌体阳性标志蛋白TSG101、ALIX、Syntenin-1(SYN)、EEA-1的表达，同时阴性标志蛋白calnexin(CANX)未能检出(图3D)。

图1 过表达IL-3的质粒构建及验证

图2 流式细胞测量术和免疫荧光技术鉴定IL-3稳定转染细胞株

图3 过表达IL-3外泌体的表征鉴定

2.4 过表达IL-3的293T细胞外泌体可促进BV-2细胞对Aβ蛋白的吞噬

在体外利用小鼠的小胶质细胞BV-2和免疫荧光技术，探究过表达IL-3的293T细胞外泌体对小胶质细胞吞噬Aβ能力的影响。结果显示，与单独加入Aβ和加入了WT-exo的BV-2细胞相比，加入IL-3-exo的BV-2胞内吞噬了更多的Aβ蛋白，且IL-3-exo与重组IL-3蛋白的促吞噬效果相当(图4)。表明IL-3-exo能在体外发挥作用，促进BV-2细胞对Aβ蛋白的吞噬。

3、讨论

阿尔茨海默病是目前最为常见的神经退行性疾病，其主要特征是神经元的退行性死亡伴随进行性的认知功能减退，其典型病理特征为Aβ淀粉样蛋白的沉积。IL-3,也称为多集落刺激因子，是一种与炎性反应和自身免疫性疾病有关的多功能细胞因子[5]。在神经系统中，IL-3作为星形胶质细胞-小胶质细胞交流对话的一个关键媒介，参与了多种生理病理的调节过程[6,7]。有研究表明，在AD患者样本和小鼠模型中，星形胶质细胞来源的IL-3可促进小胶质细胞向Aβ淀粉样蛋白迁移聚集并可促进其吞噬清除Aβ的能力，从而缓解AD病理变化和认知障碍，有望成为AD治疗干预的新选择[2]。外泌体自发现以来便成为研究应用的热点，几乎所有细胞都可以分泌，由于它会保留其来源细胞的诸多特性，因此利用体液中广泛存在的外泌体对疾病进行早期诊断[8],还可反映疾病的进展和治疗效果，为医生制定个性化治疗方案提供有力支持。此外，由于外泌体的免疫原性低，体内清除率低，还能向病变部位运送功能物质，因此有望成为治疗药物的载体[9]。更值得注意的是由于外泌体可透过血脑屏障，到达脑部组织，所以在神经系统领域展现出极大的应用潜力[10,11,12]。

本研究利用在前期工作中获得的一项专利结构，成功构建了IL-3融合蛋白慢病毒表达载体，并得到了稳定表达IL-3外泌体的293T稳定转染株，经透射电镜与纳米流式观察到了IL-3外泌体的结构，Western blot验证了IL-3分子与外泌体标志蛋白的表达。体外功能实验表明，IL-3外泌体能促进小胶质细胞对Aβ的吞噬作用以及向Aβ迁移聚集的能力。

图3 过表达IL-3外泌体的表征鉴定

综上所述，本研究成功获得了过表达IL-3的基因工程化293T细胞外泌体，可进一步在小鼠动物模型中进行体内验证，并且有望在阿尔茨海默病及相关神经系统疾病中得到进一步的研究和应用。此外，由于构建的表达IL-3外泌体的细胞稳定转染株能不断收获带有IL-3的外泌体，可为后续的临床治疗提供新的思路与方法。

参考文献:

[12]刁华琼,李小黎,林亮吟,等.外泌体microRNAs与阿尔茨海默病关系的研究进展[J].基础医学与临床,2020,40:1542-1545.

基金资助:国家自然科学基金(82071791,32300745); 中国医学科学院创新工程(2021-I2M-1-035);

文章来源:高璐,蔡孟华,许依,等.过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的纯化及体外功能验证[J].基础医学与临床,2024,44(07):947-953.