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NRF2通路激活抑制酒精依赖小鼠前额叶GABRB3表达的机制分析

2025-08-12 51 上传者：管理员

摘要：目的：研究NRF2通路激动剂对酒精依赖小鼠前额叶GABRB3表达的调节作用及机制。方法：实验采用腹腔注射法构建持续酒精摄入小鼠模型；选用NRF2通路激动剂TBHQ干预模型小鼠；实时荧光定量PCR检测HMGB1/TLR4通路、炎性因子IL-1β、MAPK通路基因JNK、P38、ERK以及GABRB3 mRNA表达。结果：TBHQ干预后，与酒精组相比较，HMGB1、TLR4、IL-1β mRNA表达水平降低；GABRB3 mRNA表达降低；MAPK通路中的p38 mRNA表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶炎性通路HMGB1/TLR4基因及炎性因子IL-1β mRNA表达；抑制MAPK通路中的p38以及功能基因GABRB3表达，发挥抗氧化及神经保护作用。

关键词：
GABRB3
HMGB1/TLR4
Nrf2
小鼠模型
酒精依赖
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持续酒精摄入会引起脑区多种生理及病理改变,形成酒精依赖｡有研究指出,神经递质释放及受体表达广泛参与酒精依赖的形成及治疗过程,如γ-氨基丁酸受体[1];但目前,对于酒精依赖形成的具体机制尚不明确,仍缺乏有效的治疗手段｡前期研究表明,核因子E2相关因子2(nuclearfactore2-relatedfactor2,NRF2)通路在抗氧化应激和抗炎中起着重要作用[2];NRF2通路作为内源性抗氧化途径,通过与抗氧化反应元件(antioxidantreactioneiement,ARE)结合来调控抗氧化酶的表达,从而发挥其抗氧化应激及抗炎的作用[3]｡在此基础上,后续研究进一步证实,持续酒精摄入能够降低小鼠前额叶NRF2及血红素氧合酶(hemeoxygenase-1,HO-1)转录及蛋白表达水平,提示持续酒精摄入能够抑制小鼠前额叶NRF2通路活性;但目前尚缺乏NRF2通路在酒精依赖发病及治疗中的作用研究,其具体机制仍需进一步分析｡

为了进一步分析酒精依赖形成的具体机制,本研究对酒精依赖雄性小鼠基因芯片数据进行分析,结果显示:在前额叶及纹状体中,吗啡成瘾通路均存在明显差异;团队进一步验证实验显示,该通路涉及基因γ-氨基丁酸A受体β3亚基(gamma-aminobutyricacidtypeareceptorsubunitbeta3,GABRB3)转录及蛋白水平在酒精依赖小鼠模型前额叶及纹状体均明显升高[4]｡这一结果说明,酒精依赖模型小鼠前额叶及纹状体都存在吗啡成瘾通路改变;吗啡成瘾通路关键基因GABRB3与酒精依赖的形成密切相关,是酒精依赖形成的关键基因之一｡但目前其在酒精依赖发病及治疗中的调节机制尚不清楚｡

在此基础上,本研究拟通过构建小鼠酒精腹腔注射模型,选用NRF2通路激动剂特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)进行干预,评估干预后模型高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox-1protein,HMGB1)通路及炎性因子水平,以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)通路的改变,并进一步分析NRF2通路激活对GABRB3转录水平的影响;为NRF2通路激动剂在酒精依赖治疗中的应用提供实验依据｡

1、材料与方法

1.1动物模型制备及分组

6~8周龄C57BL/6J小鼠(雄性)购自维通利华公司,于佳木斯大学实验动物中心饲养;实验分为3组:对照组､酒精组､TBHQ组;实验采用腹腔注射法构建持续酒精摄入小鼠模型,方法依照既往研究进行;注射剂量为2.0g/kg,1次/d,对照组以无菌PBS代替,持续注射7d｡依照前期研究成果,TBHQ组在酒精注射的基础上给予腹腔注射NRF2通路激动剂TBHQ干预,注射量为16.7mg/kg｡所有实验均经佳木斯大学附属第一医院医学伦理委员会批准,批准文号:2021-13-01｡

1.2实验试剂

NRF2通路激动剂:TBHQ购自美国SelleckChemicals公司;TRIzol购自美国ThermoFisherScientific公司;PCR逆转录试剂盒与扩增试剂盒均购自日本Takala公司;引物合成购自生工生物工程(上海)股份有限公司,引物序列见表1｡

表1实时荧光定量PCR引物序列

1.3实时荧光定量PCR检测

选用TRIzol法提取持续酒精摄入小鼠前额叶总RNA,NanoDrop检测总RNA浓度;选用PrimeScriptRTMasterMix逆转录试剂盒逆转录样本合成cDNA;选用两部法SYBRPremixExTaqII试剂盒扩增小鼠前额叶JNK､p38､ERK､TLR4､HMGB1､IL-1β及GABRB3cDNA;实验结果选用2-ΔΔCt法进行统计分析｡

1.4统计学方法

采用SPSS29软件进行统计分析,3组比较选用单因素方差分析(one-wayANOVA),多组组内比较选用LSDpost-hoctest;P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1NRF2通路激动剂对持续酒精摄入小鼠前额叶炎性通路HMGB1/TLR4及炎性因子表达的影响

本研究结果显示,与对照组相比较,酒精组HMGB1(P=0.017)､TLR4(P=0.015)和IL-1β(P=0.003)表达升高,差异有统计学意义｡提示持续酒精摄入能够提高小鼠前额叶炎性通路HMGB1/TLR4表达;经TBHQ干预后,与酒精组相比较,TBHQ组HMGB1(P=0.002)､TLR4(P=0.044)和(P=0.025)表达降低,差异有统计学意义｡提示TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶炎性通路HMGB1/TLR4及炎性因子IL-1β表达水平,发挥抗炎作用,见图1｡

图1炎性通路及炎性因子基因表达检测

2.2NRF2通路激动剂对持续酒精摄入小鼠前额叶GABRB3表达的影响

既往研究显示GABRB3是酒精使用障碍前额叶的关键差异基因,本研究结果显示:与对照组相比较,酒精组GABRB3表达升高(P=0.016),差异有统计学意义｡提示持续酒精摄入能够提高小鼠前额叶GABRB3表达水平;经TBHQ干预后,与酒精组相比较,TBHQ组GABRB3表达水平降低(P=0.003),差异有统计学意义｡提示TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶GABRB3表达水平,发挥功能调控作用,见图2｡

图2GABRB3基因表达检测

2.3NRF2通路激动剂对持续酒精摄入小鼠前额叶MAPK通路表达的影响

为了进一步分析NRF2通路激动剂抑制持续酒精摄入小鼠前额叶GABRB3表达的机制,本研究进一步分析了NRF2通路激动对MAPK通路基因表达的影响,结果显示:与对照组相比较,酒精组JNK､ERK表达无统计学差异;p38表达升高(P=0.016),差异有统计学意义｡提示持续酒精摄入能够提高小鼠前额叶p38表达水平;经TBHQ干预后,与酒精组相比较,TBHQ组JNK､ERK表达无统计学差异;TBHQ组p38表达水平降低(P=0.003),差异有统计学意义｡提示TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶p38表达水平,发挥功能调控作用,见图3｡

图3MAPK通路基因表达检测

3、讨论

研究显示,酒精依赖能够增加脑内氮氧化物表达及活性氧的生成,进而促进氧化应激反应;同时,活性氧进一步参与酒精诱导的小胶质细胞活化过程,促进炎性通路活化[5]｡NRF2通路是内源性抗氧化应答通路之一,发挥抗氧化应激作用[3,6]｡在脑出血模型中,激活NRF2通路能够抑制IL-1β的表达;同时促进NRF2表达能够抑制小鼠小胶质细胞炎性因子如IL-6,IL-1β及TNF-α的表达;这一结果说明,NRF2通路参与炎性因子表达的调节过程｡本研究结果进一步显示,NRF2通路激动剂能够完全逆转持续酒精摄入引起的前额叶IL-1β转录水平升高､促炎因子高迁移率族蛋白B1(high-mobilitygroupbox1,HMGB1)/TLR4转录表达升高[7]｡这一结果提示,NRF2通路激动剂能够抑制酒精依赖引起的炎性反应及HMGB1/TLR4通路的表达,对酒精依赖具有治疗作用｡

GABRB3是人类中枢神经系统主要抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的主要受体亚型;作为GABA氯离子门控通道,GABRB3在抑制性突触-GABA能突触形成过程中发挥重要作用,并广泛参与突触抑制过程;通过对GABA能突触形成及功能的调控,GABRB3参与介导镇痛､躯体感觉及细胞组胺反应过程｡进一步研究显示,高加索人种GABRB3等位基因携带与酒精依赖存在相关性;而携带GABRB3G1+等位基因的酒精依赖患者,在社会压力相关负面情绪下,其拒绝饮酒效能降低｡在韩国人群中,GABRB3G1-等位基因在儿童酗酒者中更常见;在非裔美国人中,酒精依赖患者GABRB3的CpGs甲基化水平增高｡同时,在动物研究中发现,成年SD大鼠酒精摄入能够增加其雄性后代海马GABRB3基因表达;在体外细胞实验中也发现,酒精能够增加人胚胎干细胞GABRB3表达;这些结果说明,GABRB3基因表达与酒精依赖密切相关｡结合本研究前期实验结果,共同提示GABRB3基因表达广泛参与了酒精依赖的发病过程,是酒精依赖治疗的潜在靶点｡在本实验中,持续酒精摄入能够提高小鼠前额叶GABRB3表达水平;TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶GABRB3表达水平,发挥功能调控作用｡此结果提示,激活NRF2通路是调节酒精依赖小鼠前额叶GABRB3表达的潜在机制｡

进一步研究显示:在中枢神经系统中,TLR4受体激活能够调节GABA合成及突触后GABA受体活性;同时有报道指出,持续酒精摄入大鼠的雄性后代前额叶GABRB3表达升高;但酒精干预后TLR4(-/-)大鼠后代前额叶中并无此改变｡这一结果提示TLR4通路参与了酒精摄入调节脑GABRB3表达的过程｡TLR4是Toll样蛋白受体的亚型之一在酒精诱导神经病理改变的过程中发挥关键作用;HMGB1是一种内源性细胞因子,在中枢神经系统内主要由神经元分泌[8-10],通过与炎性细胞Toll样蛋白受体结合,参与炎性基因表达的调控[11];同时HMGB1也是内源性TLR4激动剂;研究显示,HMGB1在酒精依赖介导的免疫反应中发挥重要作用[9];本研究前期结果证实,在酒精依赖模型小鼠前额叶及纹状体HMGB1和TLR4表达均明显升高;同时,选用HMGB1/TLR4通路抑制剂干预酒精依赖模型小鼠,结果显示:通路抑制剂能够降低模型小鼠前额叶及纹状体GABRB3及IL-1β､TNFα表达[4]｡这一结果说明HMGB1/TLR4通路参与酒精依赖对GABRB3表达的调控过程｡本研究证实,TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶炎性通路HMGB1/TLR4表达水平,发挥抗炎作用｡进一步提示,激活NRF2通路可能通过抑制HMGB1/TLR4通路表达进而抑制GABRB3表达｡

为了进一步分析NRF2通路激动剂抑制持续酒精摄入小鼠前额叶GABRB3表达的机制,本研究进一步分析了NRF2通路激动对MAPK通路基因表达的影响,结果证实,在MAPK通路三条途径中,NRF2通路激动剂能够明显抑制p38信号通路活性;p38是MAPK信号通路重要组成部分,可被氧化应激或炎症刺激激活[12],研究显示,HMGB1的过度释放可通过促进炎症反应进一步激活p38｡本研究结果提示,HMGB1可能通过p38信号通路影响GABRB3表达,这可能是NRF2通路激动剂治疗酒精依赖的潜在机制｡

本研究通过腹腔注射酒精构建持续酒精摄入小鼠模型,选用NRF2通路激动剂TBHQ进行干预,结果显示,TBHQ能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶炎性通路HMGB1/TLR4基因及炎性因子IL-1βmRNA表达;同时TBHQ还能够降低持续酒精摄入小鼠前额叶p38及GABRB3表达水平,发挥功能调控作用｡这一结果为NRF2通路激动剂酒精依赖治疗中的应用提供实验依据,并为NRF2通路激动剂治疗机制的阐述提供实验基础｡同时,本研究集中于基因和分子水平分析,对于NRF2通路激动剂的临床疗效仍需进一步分析｡

参考文献:

[2]孙光涛,戚询中,邹春颖,等.基于Nrf2-ARE信号通路探析己酮可可碱对癫痫大鼠脑内氧化应激的影响[J].医学研究生学报,2020,33(2):144-148.

[6]王樱銮,宿星杰,张剑,等,莱菔硫烷对糖尿病视网膜病变Nrf2通路和NLRP3炎性小体的影响[J].黑龙江医药科学,2023,46(6):1-4,7.

[7]李昕曈,孙光涛,王梦,等.持续乙醇摄入通过抑制NRF2通路促进HMGB1及其下游炎性因子表达[J].重庆医学,2021,50(14):2352-2356.

[10]屈晓莉,王艳民.系统性红斑狼疮患者免疫球蛋白､HMGB1､PS-PLA1指标分析及与疾病活动度的关系[J].黑龙江医药科学,2024,47(4):145-147.

[11]王梦,朱晓峰.酒精依赖患者认知功能与血清中HMGB1､TLR4表达的相关性分析[J].黑龙江医药科学,2021,44(5):1-2,14.

基金资助:黑龙江省卫生健康委科研课题,编号:20210303090025;

文章来源:孙光涛,程瑜,郑一帆,等.NRF2通路激活抑制酒精依赖小鼠前额叶GABRB3表达的机制分析[J].黑龙江医药科学,2025,48(08):37-40.