1997年,Kuro-o及其研究团队揭示了一个重要发现:某一特定基因的缺失会显著缩短小鼠的寿命至8至9周,并诱发一系列早衰并发症,包括但不限于性腺发育不全､皮肤萎缩､动脉粥样硬化､骨质疏松､低血糖及肺气肿等[1]｡有趣的是,当该基因在小鼠体内过表达时,其寿命却得到了显著延长[2]｡这一神奇的基因被研究人员赋予了希腊女神“克洛托”之名,象征着它如同女神般旋转着生命的丝线｡Klotho蛋白主要在肾脏中表达,同时也在大脑､骨骼肌､肺部､视网膜､睾丸和卵巢等组织中有所表达[1]｡研究[1]表明,Klotho蛋白的过表达不仅有助于提升认知能力,还能有效延长生物体的寿命,同时该蛋白还具备多重生理功能,包括调节钙和磷酸盐的稳态､维持血管扩张状态､抑制血小板聚集以及发挥抗炎作用等｡

1、Klotho基因的结构与表达

Klotho基因全长达50kb,定位于人类第13号染色体的13q12区域,其结构由5个外显子和4个内含子编织而成[3]｡值得注意的是,Klotho基因的操纵子结构中并未发现传统的TATA盒和CAAT盒,相反,它独特地包含了5个潜在的转录因子SPl结合位点,这些位点与基因的表达调控紧密相关｡在外显子1及其邻近的2000bp序列中,G+C的平均含量高达66.75%,局部区域甚至达到了惊人的98%,这一数据强烈暗示了该区域内CpG岛的存在[3]｡Turan等[4]经过深入探究,进一步阐明了人类Klotho启动子区域的复杂特性,他们推测Klotho基因转录起始位点上游的500bp区域为核心启动子区域,这一重要发现对于深入理解Klotho基因的转录调控机制具有显著意义｡

目前普遍认为,Klotho基因通过选择性拼接生成两种蛋白质,以实现其生物学功能[3]｡在Klotho基因的构造中,第3号外显子区域含有一个与不均一核RNA(hnRNA)相结合的选择性剪切位点,进而产生了KL1+KL2和KL1这两种不同的转录本[3]｡当可变剪切位点未插入50bp的片段时,RNA呈现完整的结构,五个外显子均参与转录,生成全长转录本KL1+KL2,其产物为单次跨膜的结构蛋白｡相反,若在该位点插入了50bp的片段,则该插入序列末尾的两个核苷酸TA与外显子4的第一个核苷酸G结合,共同构成终止密码子TAG,此时仅1､2号外显子进行转录,生成转录本KL1,其产物为分泌型蛋白[3]｡

1.1跨膜型Klotho跨膜型Klotho是一种Ⅰ型单通道跨膜蛋白,其分子量约为130kDa｡这种蛋白主要在脑脉络膜丛上皮细胞和肾远曲小管中表达｡Klotho基因负责编码并合成一系列跨膜蛋白,包括α-Klotho､β-Klotho､γ-Klotho等｡尽管αKlotho与β-Klotho在结构上具有很高的同源性,但它们在生物体内的分布和功能却大相径庭｡具体而言,α-Klotho在大脑脉络膜丛上皮细胞和肾脏远端曲小管中呈现高表达水平,而在垂体､骨骼肌､卵巢､睾丸､胰腺､胎盘和甲状腺等组织中则表达较低[5-6]｡该蛋白在生物体内扮演着多重角色,包括参与Ca2+和磷酸盐的稳态维持,抑制氧化损伤和炎症反应,促进神经元髓鞘化及长期增强,同时还具有保护干细胞的功能[7-8]｡相比之下,β-Klotho的表达则主要分布在卵黄囊､肠道､棕色和白色脂肪组织､肝脏以及胰腺等组织中｡它主要参与代谢调节过程,包括葡萄糖摄取､胆汁酸合成以及脂肪酸代谢等关键环节[9]｡至于γ-Klotho,其主要表达于棕色脂肪､眼部和皮肤等组织｡然而,关于γ-Klotho的具体功能,目前尚不完全清楚[10]｡

1.2可溶型Klotho跨膜型Klotho蛋白的细胞外区可被α和β-分泌酶裂解,并最终进入血液､尿液和CSF[11]｡这种分裂的Klotho蛋白通常被称为可溶型Klotho｡目前,Klotho蛋白脱落的调控机制尚不明确,需进一步研究｡

1.3分泌型KlothomRNA经过选择性剪切,生成了一种稳定的蛋白质(70kDa),其在大脑中的含量相较于肾脏而言,高达十倍之多｡当前,跨膜Klotho亚型已成为科研领域的热门话题,然而,分泌型Klotho的生物学功能尚未完全揭示,仍有待我们进一步深入探索｡

2、Klotho基因多态性

Klotho基因上有400多个单核苷酸多态性(SNPs)｡目前研究比较清楚的多态性位点有15个,1个位于起始密码子区;14个位于编码区:5个位于外显子1,其中3个为错义突变;3个位于外显子2,其中2个为错义突变;1个位于外显子3,为错义突变;5个位于外显子4,其中1个为错义突变;1个位于外显子5,为错义突变｡

2002年,Arking等[12]在美国人群中识别出Klotho基因在外显子2及其邻近区域存在6个SNP位点｡其中,3个位点位于编码区,包括2个错义突变(F352V和C370S)和1个同义突变;另外3个则位于非编码区域,表现为沉默突变｡Arking等[12]将这6个SNP的组合称为KL-VS等位基因｡

具体而言,关键的错义突变F352V和C370S均位于外显子2｡F352V突变导致Klotho蛋白中第352位的保守性极高的苯丙氨酸被缬氨酸所取代,而C370S突变则引起370位氨基酸由半胱氨酸转变为丝氨酸｡这些变化显著影响了蛋白的功能,进而对Klotho基因的生物学作用产生深远影响｡因此,F352V和C370S的多态性在Klotho基因研究中占据了重要地位,具有极高的研究价值｡

Klotho基因的多态性显著地影响着Klotho蛋白的表达水平,进而在某些疾病的发病过程中扮演着关键角色｡具体而言,Klotho基因启动子序列中的G-395A变异与高血压､冠心病[13]､动脉粥样硬化[14]､糖尿病肾病[15]以及慢性肾病[16]等疾病的发病风险紧密相关;而F352V变异则与早发性冠心病､血压及血脂水平的异常变化有显著联系[12]｡

Tank等[17]的研究揭示,在60~80岁的人群中,KL-VS杂合子与β-淀粉样蛋白负荷的减少以及Alzheimer,s病(AD)风险的降低存在显著关联｡值得注意的是,当年龄超过80岁时,拥有KL-VS杂合子基因型的健康对照组个体,其转化为轻度认知功能障碍或AD的风险也会显著降低[18]｡

此外,Klotho基因还展现出了独特的抗衰老特性,并在认知功能中发挥着重要作用｡研究[12]表明,Klotho能够引起海马体和皮质突触结构的积极变化,从而有效地减缓认知能力下降的速度,这对于维护个体的认知健康具有重要意义｡

3、血管性认知功能障碍(VCI)

VCI是一种由脑血管病变及其相关危险因素所引发的临床或亚临床血管性脑损伤,其特点为至少一个认知领域的受损,构成了一个涵盖从轻度认知障碍至痴呆范围的临床综合征[19-20]｡VCI被认为是继AD之后第二常见的痴呆类型,患者数量大约占到所有痴呆病例的15%~20%[21]｡国内流行病学研究[22]表明,在中国65岁及以上的老年人群中,VCI的患病率为8.7%｡此外,加拿大健康与老龄化研究所的一项研究[19]发现,在65~84岁的受访者中,VCI患者面临更高的死亡率和住院风险｡VCI的发生与多种常见的血管危险因素相关,包括高龄､高血压､糖尿病､心房颤动､脑卒中和吸烟等｡这些因素共同作用,导致脑部大､中､小动脉的持续性损伤,进而引发神经退行性病变和认知功能的减退｡根据病理学特点,VCI可分为多发性梗死(皮质血管)性痴呆､关键部位梗死性痴呆､小血管(皮质下血管)性痴呆､低灌注性痴呆､出血性痴呆,以及遗传性血管性痴呆(VaD)(包括常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病)和AD伴脑血管病(神经变性和血管损伤同时发生),以前四种常见[23]｡

3.1脑梗死研究[24]指出,较大的梗死体积､特定脑区中梗死数量的增多,以及皮质下小梗死灶的存在,均显著提升了血管性轻度认知功能障碍和VaD的发病风险｡此外,当梗死发生在大脑的关键区域时,痴呆的严重程度似乎与病灶的大小无关,即便是单个腔隙性梗死(LI)也可能引起严重的认知功能障碍｡这些关键部位的梗死解剖位置通常包括皮质区域的海马体､角回､扣带回,以及皮质下结构如丘脑､基底神经节､穹窿,还有尾状核和苍白球等[25]｡

卒中患者常常表现出多种血管性脑损伤的病理和影像学特征,因此,卒中后痴呆也可以被进一步描述为多发性梗死性痴呆､皮质下缺血性VaD以及混合性痴呆等多种形式[26]｡

研究[27-28]表明,Klotho蛋白水平与缺血性脑卒中引起的VCI具有显著相关性,其水平可作为预测缺血性脑卒中后VCI发生的重要标志物｡在脑梗死急性发作期,Klotho蛋白水平显著下降,并且该蛋白水平与梗死体积和NIHSS评分之间存在负相关[28];此外,Klotho蛋白对卒中后认知功能障碍(PSCI)的发生具有一定的预测价值,并且与脑梗死患者的蒙特利尔认知评估量表呈正相关[29]｡血浆Klotho浓度升高与急性缺血性卒中患者的良好功能结果相关[30]｡

3.2脑小血管病(CSVD)CSVD是由多种病因引发的,主要影响脑内小动脉､微动脉､毛细血管､微静脉和小静脉的一系列临床､影像学和病理学综合征｡这些小血管主要源自软脑膜血管网和颅内大血管的深穿支,负责为脑部的深部白质或灰质核团提供关键的血液供应｡

临床上通常依赖影像学特征作为评估CSVD的主要手段｡这些影像学特征涵盖脑白质病变和LI,还包括脑微出血及血管间隙扩大､脑萎缩以及遗传性动脉病等,其中前三种类型尤为常见[31]｡

脑白质纤维结构破坏是脑缺血性损伤时常见病变部位,主要表现为联合纤维､联络纤维和投射纤维的广泛破坏｡当与高级神经功能相关的神经纤维受损时,会导致脑区间信息传递障碍或中断,进而出现认知障碍｡同时,研究[32]表明,脑白质病变会导致胆碱能系统受损,进而引发认知功能障碍｡胆碱能系统参与调节脑血流量,其破坏和功能障碍会导致脑部血流量减少和低灌注,从而加剧脑白质病变,形成恶性循环｡

Kuriyama等[33]研究显示,CSVD患者Klotho水平明显降低,并且随CSVD患者病情加重,Klotho蛋白水平呈明显下降,同时伴认知功能障碍患者血清Klotho蛋白水平明显低于无认知功能障碍患者[34]｡Woo等[35]研究发现,血浆Klotho浓度与CSVD的存在和进展呈负相关｡

3.3脑灌注不足全脑灌注的下降可诱发短暂或长期性的脑部缺血状况,进而可能导致VCI的发生｡RECON试验(颈动脉闭塞和神经认知随机评估)[36]明确揭示了血流动力学障碍的存在,这一发现进一步证实了单侧颈动脉闭塞与认知障碍之间存在显著的独立关联性｡即便在没有脑组织梗死的情况下,单纯的颈动脉闭塞或严重狭窄也足以独立地引发认知障碍｡

通过PET研究[37]揭示,VCI患者的脑内血流分布显示出以额叶为中心的低灌注｡与健康对照组相比,VCI患者的脑血流和氧代谢水平显著降低,尤其是额叶区域的脑血流和氧代谢水平较高｡这一发现表明,VCI的发生与脑部多发性梗死的形态学特征密切相关,并且与脑皮质的病变也有着重要的联系｡

陈方方等[38]通过双侧颈总动脉闭塞术诱导大鼠慢性脑低灌注,导致大鼠的认知功能障碍,同时在大鼠模型中检测到Klotho蛋白表达显著下调,故有理由相信Klotho蛋白通过某种途径调控了大鼠的认知功能障碍｡

4、Klotho蛋白与VCI

4.1减轻血管内皮损伤研究[39]表明,内皮功能损伤与VCI发展密切相关｡微血管内皮功能的损伤障碍已成为近年来认知障碍发生的一个关键风险因素[39]｡Guliaev等[40]在动物实验中发现,血管舒张因子NO的生成减少,导致血管收缩｡这种血管收缩与内皮细胞的脱落相互作用,共同导致内皮功能障碍｡这种障碍进而引起脑血流减少和血-脑屏障稳定性的改变,最终导致脑结构的缺血性损伤和认知障碍｡同时研究表明,相较于野生型小鼠,杂合子Klotho基因敲除小鼠的主动脉及小动脉血管舒张能力显著下降,且这些小鼠尿液中NO2-和NO3-的排泄量也明显降低｡研究[41]表明,小鼠体内NO合成能力的显著下降｡然而,通过腺相关病毒介导的Klotho蛋白过表达于该动物模型体内,能够显著增强主动脉的舒张功能并促进NO的合成[42]｡这些研究结果共同支持了Klotho蛋白通过NO相关途径改善内皮功能障碍的论断,从而改善认知功能｡

4.2抗氧化应激氧化应激和炎症是VCI关键致病因素[43]｡在这种炎症与氧化应激的循环中,持续的血管损伤会破坏血-脑屏障的完整性,增加其通透性,进而加剧组织缺氧,损害神经元和脑白质,最终导致认知功能的退化｡Klotho蛋白能够上调体内抗氧化酶的活性,清除过多的自由基,减轻氧化应激对血管内皮的损害｡Kurosu等[2]成功地将Klotho基因导入Klotho完全缺失(Kl-/-)的衰老小鼠模型中,并干扰了insulin/胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号通路,结果显著改善了小鼠的衰老症状｡分析其潜在机制可能是Klotho通过抑制insulin/IGF-1受体的酪氨酸磷酸化,进而降低胰岛素受体底物1､2以及磷脂酰肌醇激酶3的活性,从而实现对insulin/IGF-1信号转导的抑制｡不仅如此,Klotho还通过调控多种抗氧化通路来强化血管壁的防御机制｡具体而言,它被发现能够提升超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等关键抗氧化酶的基因表达水平,这些酶在清除体内有害的活性氧分子中扮演核心角色｡通过减少活性氧的积累,Klotho有效遏制了氧化应激引发的炎症反应和脂质过氧化,从而保护了血管内皮细胞的完整性和正常功能,从而改善了VCI｡

4.3抗炎作用研究[44]表明,VCI患者在临床前期和临床各阶段均存在慢性炎症｡其主要机制就是通过激活炎性免疫反应细胞,进而诱导细胞毒性酶的产生,形成氧化损伤,并引起毛细血管收缩性改变,进而释放大量炎性细胞因子,引发中枢神经损害和认知功能的减退｡在认知障碍患者中,血清中炎症因子如IL-1β､IL-6､TNF-α､转化生长因子β､单核细胞趋化蛋白-1等水平显著升高,表明炎症因素在认知功能下降中扮演了推动角色｡然而,脑血管病后认知改变的机制是复杂多变的｡同时一些研究[45]也指出了免疫衰老可能加速痴呆的进程｡Klotho可下调人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的表达;而在Klotho基因敲除的内皮细胞中,细胞黏附分子的表达则显著增加｡此外,Klotho还可阻断TNF-α诱导的单核细胞黏附,并可抑制经典核因子-κB炎症通路的激活,从而拮抗炎症反应的启动和扩散[45]｡在体内实验[46]中也观察到,Klotho的过表达显著降低了IL-6的分泌｡在TNF-α攻击后,Klotho过表达细胞中升高的IL-6产生也明显减弱,这些数据揭示了Klotho在抑制IL-6产生方面的有效作用[46],从而改善认知功能｡

4.4自噬自噬是CNS清除异常蛋白和受损细胞器的主要途径[47],通过自噬体-溶酶体途径再循环细胞内成分｡研究[48]表明,VCI病程的进展与神经元凋亡和自噬紧密相连｡雷帕霉素能够通过PI3K/Akt/mTOR通路调控线粒体自噬进而防止神经元凋亡和线粒体功能障碍,从而有效缓解了VCI大鼠的神经元损害和认知功能障碍[49]｡ULK1-ATG13-FIP200复合体对自噬启动至关重要,它负责整合上游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-P38和mTOR信号通路,从而影响自噬小体生成｡在细胞模型上,Klotho的沉默导致活性上升和MAPK失活,减少自噬相关蛋白13磷酸化,阻碍ULK1复合体的形成,导致细胞走向凋亡[47]｡因此,Klotho诱导自噬的部分机制是通过促进ULK1复合体的形成来实现的｡此外,由于Klotho的缺乏会显著增加IGF-1的磷酸化,进而增加下游Akt及mTOR的磷酸化,抑制自噬[50],因此Klotho还通过抑制IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路来控制自噬水平,从而改善认知功能｡Klotho蛋白还能够通过与自噬相关蛋白Beclin-1相互作用,增强自噬体的形成,从而促进细胞内受损成分的清除[51]｡因此,Klotho蛋白的表达水平与自噬活性密切相关,进而影响细胞的生存和功能｡Klotho蛋白通过促进自噬,可能有助于清除受损的细胞器和蛋白质,减轻炎症反应,从而保护神经细胞免受进一步损伤｡此外,Klotho蛋白还可能通过调节自噬过程,影响血-脑屏障的完整性,减少缺氧诱导的损伤[52]｡

5、总结与展望

Klotho基因被誉为抗衰老的基因,通过选择性剪切的方式编码Klotho蛋白｡由于SNPs位点的基因突变,Kl-VS杂合性出现,显著地影响着Klotho蛋白的表达水平,进而在某些疾病的发病过程中扮演着关键角色｡总体而言,Klotho蛋白对认知功能具有保护作用,其表达水平的提升主要通过减轻炎症和氧化损伤等途径,改善相关疾病的发病情况,并降低各种类型认知功能的衰退速度｡VCI是一个复杂的疾病过程,涉及多个基因和环境因素的交互作用｡Klotho基因及蛋白作为其中的一个潜在因素,提供了研究这一疾病的新视角｡未来的研究需要深入探究Klotho基因及蛋白的具体作用机制,以及其在VCI预测､诊断和治疗中的潜在应用价值｡通过全球范围内的合作与努力,本研究小组有望为这一疾病的治疗和康复做出更大的贡献｡

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基金资助:南京市医学科技发展项目(ZKX21061);

文章来源:尚羽,刘久玲,叶民.Klotho基因及蛋白与血管性认知功能障碍相关性的研究[J].临床神经病学杂志,2025,38(03):217-221.