布鲁菌病(以下简称布病)是全球流行的人畜共患传染病，此病慢性化程度高，长期持续感染无法完全治愈，且复发率高，对人类健康和社会公共安全存在很大的威胁[1,2,3]。目前对于布病的临床症状评估局限于医生主观判断和常用检测指标如白细胞计数，然而近期研究发现外周血白细胞在急性期、慢性期布病病程中并无明显差异[4],此外，急性期、慢性期布病的诊断监测主要依靠虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)等定性检测，诊断效能欠佳。因此亟待建立简易、可量化和价廉的急性期布病预测指标作为临床常规，早期防止布鲁菌对全身多器官持续损害，对于进一步提高布病患者生活质量具有重要意义[5]。

白细胞分化抗原64(CD64)是高亲和力免疫球蛋白IgG的Fc段受体1型(FcγR1),可通过抗体依赖性细胞毒和细胞吞噬及免疫复合物清除作用清除病原微生物，介导机体的体液免疫和细胞免疫，其主要分布于巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞等细胞表面[6],在淋巴细胞中不表达，在中性粒细胞表面其表达水平极低，然而，在机体发生感染引起炎症反应时，中性粒细胞受到细菌内毒素、细菌脂多糖(LPS)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和干扰素-γ(IFN-γ)等刺激因素而被活化，在4～6 h内中性粒细胞表面上CD64的表达迅速增高[7],而单核细胞和淋巴细胞表面CD64表达变化不大，因此中性粒细胞表面CD64的变化被认为可以反映宿主免疫系统对细菌感染的反应状态[8],具有较高的临床应用价值。近年来，中性粒细胞CD64(nCD64)指数作为监测感染的特异性指标，被广泛应用于脓毒血症、败血症、肺炎和自身免疫性疾病等疾病的早期诊断，具有良好的前景。而目前鲜有文献报道nCD64指数在布病患者中表达的情况。本研究拟通过分析外周血nCD64指数在急性期和慢性期布病患者中的情况，探讨nCD64指数在鉴别诊断急性期和慢性期布病中的临床应用价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2021年2月至2023年5月就诊于新疆维吾尔自治区人民医院感染科的急性期布病患者38例作为急性组，其中男31例，女7例；年龄(37.71±8.57)岁。另选取同期慢性期布病患者48例作为慢性组，其中男35例，女13例；年龄(38.17±9.05)岁。同时本研究选取同期在新疆维吾尔自治区人民医院体检的40例体检健康者作为健康对照组，其中男30例，女10例；年龄(36.32±8.55)岁。3组研究对象的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究已获得新疆维吾尔自治区人民医院伦理审查委员会的批准，所有受试者或家属均签署知情同意书。

1.1.1诊断标准

符合中华人民共和国卫生行业标准WS269-2019《布鲁菌病诊断》标准[9],包括临床确诊病例和确诊病例。临床确诊病例：符合流行病学史和实验室初筛中任一项。确诊病例为符合流行病学史或临床表现并同时符合实验室确诊中任一项。临床分期：急性期为病程在3个月以内，出现确诊的血浆学阳性反应；慢性期为病程超过6个月仍未痊愈，有布病的症状和体征，并出现确诊的血浆学阳性反应。

1.1.2纳入标准

(1)有明确的流行病学史；(2)有典型的临床表现(发热，乏力，骨关节疼痛，肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等);(3)RBPT阳性；(4)SAT滴度1∶100及以上；(5)布鲁菌培养阳性。以上符合(1)且(3)、(1)或(2)且(4)或(5)。

1.1.3排除标准

(1)有其他系统如呼吸、心脑血管、消化、神经等系统疾病或器官功能障碍病史；(2)有自身免疫性疾病，有免疫功能缺陷，长期使用或近3个月内使用免疫调节药物；(3)肿瘤；(4)合并其他细菌、真菌、病毒感染；(5)合并伤寒、副伤寒、结核病等感染性疾病；(6)临床资料缺失。

1.1.4病情严重程度评估

临床目前根据患者症状和体征评估布病患者疾病严重程度，本研究根据常见临床症状，如发热，多汗，腰痛、肌肉和(或)关节疼痛，肝、脾、淋巴结肿大，神经系统症状，泌尿生殖系统症状等对患者进行赋分评估疾病严重程度，出现1种症状累加1分。

1.2仪器与试剂

流式细胞仪(美国安捷伦公司生产，型号：NovoCyte),全自动血液分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：BC7500)。CD64-PE(美国安捷伦公司生产，批号：8929997)、HLA-DR-APC(美国安捷伦公司生产，批号：8929999)、CD14-FITC(美国安捷伦公司生产，批号：8929996)、CD45-PerCP(美国安捷伦公司生产，批号：8929998)、溶血素(美国安捷伦公司生产，批号：891B604)。RBPT试剂盒(赛诺利康生物技术有限公司生产)、SAT试剂盒(赛诺利康生物技术有限公司生产)。

1.3方法

1.3.1标本采集

所有研究对象均于清晨空腹、平静状态下采集肘静脉血3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，颠倒混匀，1 h内进行检测。

1.3.2 nCD64指数的检测和计算

取EDTA抗凝的外周血50μL加入CD64-PE、CD45-PerCP、CD14-FITC、HLA-DR-APC抗体各5μL,振荡混匀，室温避光孵育60 min后，加入溶血素，振荡混匀，室温避光孵育20 min,采用安捷伦流式细胞仪检测，采用NovoExpress软件进行数据获取和分析，以CD45-PerCP标记淋巴细胞，CD64-PE标记中性粒细胞，CD14-FITC、HLA-DR-APC标记单核细胞。在FSC-H和FSC-A散点图中圈出单个细胞群，在CD45和SSC散点图中圈出粒细胞群及淋巴细胞群，在CD14和SSC散点图中圈出单核细胞群，使用CD64和Count柱状图分别显示粒细胞群、淋巴细胞群及单核细胞群中CD64阳性荧光强度中位值。计算公式为：(中性粒细胞CD64平均荧光强度/淋巴细胞CD64平均荧光强度)/(单核细胞CD64平均荧光强度/中性粒细胞CD64平均荧光强度)。以淋巴细胞作为阴性对照，单核细胞作为阳性对照。

1.3.3 RBPT

取25μL待检血清滴于干净玻片，吸取25μL抗原滴于玻片血清中充分混匀，室温静置5 min观察结果，同时设立空白对照、阳性对照、阴性对照进行比对。结果判定：++++为出现大的凝集块，液体完全清凉透明，即100%凝集；+++为有明显的凝集片，液体几乎完全透明，即75%凝集；++为有可见的凝集片，液体不甚透明，即50%凝集；+为液体均匀浑浊，只有少量粒状物，即25%凝集；-为液体均匀浑浊，即不凝集。

1.3.4 SAT

准备5支试管，第1支试管加入2.3mL生理盐水，其余试管加入0.5 mL生理盐水。取0.2 mL待检血清加入第1支试管2.3 mL生理盐水内，混匀后取0.5 mL加入第2支试管做1∶1稀释，第2支试管混匀后取0.5 mL加入第3支试管做1∶1稀释，以后各血清稀释试管以此类推，第1支试管内应弃去1.5 mL剩余稀释血清，后一试管弃去0.5 mL剩余稀释血清，留下0.5 mL为试验用。将布鲁菌抗原稀释液0.5 mL分别加入以上各试管，各管内待检血清分别稀释为1∶25,1∶50,1∶100,1∶200,1∶400。充分振荡后置(37±l)℃温箱中孵育20～22 h,取出室温静置2 h,以比浊管为标准判定结果。同时设立阴阳对照管进行比对。结果判定：++++为完全凝集，上层液100%清亮；+++为几乎完全凝集，上层液75%清亮；++为显著凝集，上层液50%清亮；+为有微量凝集，液体25%清亮；-为无凝集，液体不清亮。每份血清滴度是以出现“++”及以上的凝集现象为最高血清稀释度。

1.4统计学处理

采用SPSS26.0统计软件进行数据处理及统计分析，符合正态分布的计量资料以

表示，组间比较采用t检验；非正态分布计量资料以M(P25,P75)表示，组间比较采用非参数秩和检验。相关性分析采用Spearman检验分析。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积(AUC),以及其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度，利用ROC曲线确定nCD64指数最佳截断值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1nCD64指数在3组中的表达

急性期布病患者的nCD64指数为6.23(3.37,9.01),慢性期布病患者的nCD64指数为1.16(0.62,2.38),健康对照者的nCD64指数为0.45(0.34,0.75),急性期布病患者、慢性期布病患者、健康对照者的nCD64指数依次降低，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 3组nCD64指数比较  

2.2nCD64指数、RBPT、SAT与布病病情严重程度的相关性分析

在所有布病患者中，nCD64指数与病情严重程度呈较强正相关(r=0.670,P<0.001),而WBC、RBPT、SAT与病情严重程度相关性较弱(r=0.285、0.348、0.363,P=0.008、0.001、0.001)。

2.3nCD64指数在鉴别诊断急性期和慢性期布病中的价值评估

nCD64指数鉴别诊断急性期和慢性期布病的AUC为0.882(95%CI:0.811～0.952,P<0.001),最佳截断值为2.81,灵敏度83.3%,特异度81.6%,阳性预测值80.4%,阴性预测值81.9%,准确度82.6%,nCD64指数对急性期和慢性期布病的鉴别诊断价值较高。RBPT鉴别诊断急性期和慢性期布病的AUC为0.667(95%CI:0.552～0.782,P=0.008),最佳截断值为++,灵敏度77.1%,特异度55.3%。SAT鉴别诊断急性期和慢性期布病的AUC为0.715(95%CI:0.604～0.827,P=0.001),最佳截断值滴度为1∶100,灵敏度52.6%,特异度80.4%。见图2。

图2 nCD64指数、RBPT和SAT鉴别诊断急性期和 慢性期布病的ROC曲线图  

3、讨 论

布病发病范围广泛，世界范围内每年新增病例约50万例。迄今，我国已有30多个省发生过不同程度的布病流行，尤其新疆是布病的高发地区，该病被列为重大公共卫生问题[10,11]。就布鲁菌细胞内寄生的特性来看，长期持续感染无法完全治愈，导致此病慢性化程度高，且易复发。当急性期布病初期时临床表现可能隐匿不易觉察，容易被临床误诊和漏诊，延误治疗导致病情加重。因此，对于布病早期的判断和适当、及时、有效地处理，是改善患者预后的关键。然而布病目前只有诊断指标，并没有用于监测疾病进展和治疗效果的指标，无法界定患者疾病阶段，以及评价治疗效果是否到位，导致很多时候临床只能依照经验判断。目前细菌学培养是布病诊断的金标准[12],但这样方法不适用于治疗后的患者，因为细菌培养难度大，且标本阳性率极低。此外，辅助诊断的血清学检测技术，如RBPT、SAT、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金标试验(GICA)等方法均用于检测布病抗体[13,14,15,16],仅提示机体感染布鲁菌，不能反映病情严重程度，存在局限性，无法发挥免疫监控和治疗效果评价的作用。因此，亟待寻找一个可靠而敏感的指标助力临床布病早期的诊断。

近年来，有研究提出nCD64指数可作为感染早期诊断及预后评估的新指标，如在细菌和病毒相关性感染的鉴别[17]、自身免疫性疾病活动期或合并感染的判断[18],以及脓毒血症[19]、烧伤感染[20]等患者病情的动态监测中均具有显著的应用前景。然而目前nCD64指数在布病中的临床应用鲜有研究，因此本研究根据nCD64指数在急性期和慢性期布病患者中的变化特点，评估nCD64指数在鉴别诊断急性期布病和慢性期布病中的作用。

本研究结果显示，nCD64指数在急性期、慢性期布病患者中均出现升高，尤其以急性期患者中升高程度更明显，该结果说明布鲁菌急性感染机体时，在吞噬细胞中不断繁殖，释放LSP,G-CSF、IFN-γ诱发机体内环境产生复杂的免疫反应，促使中性粒细胞激活，CD64在细胞表面大量表达，此过程不仅增加受体数目，而且提高氧化新陈代谢[21]。当疾病进入慢性期，以迟发型变态反应为主，炎症刺激减弱，CD64水平明显下降[22]。此外，根据布病患者症状和体征评估疾病严重程度，发现nCD64指数与疾病严重程度呈正相关，而辅助诊断布病的检测RBPT、SAT与疾病严重程度无相关性。同时发现布病患者WBC与疾病严重程度也无相关性，虽然该项指标在细菌感染中常被用于临床评估，但在整个布病病程中，WBC正常或稍低，无法及时提示机体炎症。而nCD64指数不受年龄及免疫状态的影响，在老人、儿童及免疫低下人群中都适用，并且在影响中性粒细胞计数的特殊情况中均不受影响，可见nCD64指数的稳定性及准确性均较好[17]。

ROC曲线分析结果显示，nCD64指数的最佳截断值为2.81,在鉴别诊断急性期和慢性期布病方面具有较高的灵敏度和特异度，同RBPT、SAT结果相比，nCD64指数的诊断效能明显优于两项定性试验。该结果表明，nCD64指数在鉴别诊断急性期和慢性期布病中具有良好的应用价值，并且倾向于反映疾病的严重程度，对指导临床早期诊断和治疗效果监测起到重要的作用。

综上所述，nCD64指数可以作为布病早期诊断的标志物，具有较高的灵敏度和特异度，并可进一步作为疾病严重程度及治疗效果评价的指标。nCD64指数的优势是一个客观的检测值，抗干扰能力强，不受检验医生的主观因素影响，且检测流程便捷，可辅助临床医生及早判断布病病程的阶段，采取适当、有效的措施控制患者病情的发展，最终减轻患者的病痛折磨和经济负担，提高患者的生命质量。

参考文献:

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[9]罗波艳,聂守民,王曦迎,等.《布鲁氏菌病诊断》(WS 269-2019)标准应用的调查评价[J].中国人兽共患病学报,2023,39(5):509-514.

[16]张国庆,韩敏,韩来红,等.三种布鲁氏菌血清学方法的评价[J].国际检验医学杂志,2017,38(13):1842-1844.

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[21]周彦,刘小林,杨林.定量检测CD64在慢性前列腺炎诊断中的研究[J].中华医院感染学杂志,2012,22(1):213-215.

[22]朱锐锋,胡喜梅,周水阳,等.CD64结合其他炎症指标在细菌感染诊断中的意义[J].中国感染与化疗杂志,2016,16(6):726-729.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金杰出青年科学基金项目(2022D01E30);新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2023D01C83,2023D01C84);新疆维吾尔自治区科技厅“天山英才”培养项目(2022TSYCCX0102);新疆维吾尔自治区科技厅自治区科技支疆项目(2022E02118);

文章来源:李智伟,王倩,王玲玲,等.中性粒细胞CD64指数在布鲁菌病中的临床应用价值[J].国际检验医学杂志,2024,45(13):1541-1545.