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口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA及预后意义

2020-07-08 394 上传者：管理员

摘要：目的:筛选口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者外周血差异表达的microRNA(miRNA),探讨其与临床参数及其预后意义。方法:利用qRT-PCR技术检测OSCC外周血中miRNA的变化,扩大样本量进行验证,并分析miRNA与OSCC临床病理指标和预后的关系。结果:总共检测84种miRNA,其中OSCC患者外周血中上调大于2倍的miRNA有8个;下调小于0.5倍的有18个。其中miR-222-3p和miR-423-5p在外周血的表达与pTNM分期和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。miR-222-3p高表达和miR-423-5p低表达的患者生存期均较短(P<0.05)。多因素分析结果提示miR-222-3p高表达可作为OSCC患者生存的独立预后因素。结论:miR-222-3p和miR-423-5p在OSCC患者外周血中存在差异表达,并有望成为OSCC早期诊断和预测预后的生物标志物。

关键词：
miR-222-3p
miR-423-5p
口腔肿瘤
口腔鳞状细胞癌
生物标志物
预后
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口腔癌属于头颈部肿瘤,而口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是主要的组织学类型,占口腔癌的95%[1]。尽管取得了巨大的治疗进展,但OSCC的5年生存率仍然很低[2]。OSCC预后不良的主要原因是大多数患者无症状,常在晚期诊断。因此开发可靠的生物标志物对早期发现OSCC具有重要意义。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为19～25个核苷酸的内源性单链非编码RNA[3]。他们通过互补结合靶mRNA的3’非翻译区来负性调控基因表达。miRNAs在增殖、分化和凋亡等重要的细胞功能中起关键作用。miRNA在人类肿瘤中异常表达,作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发展过程中发挥作用[3]。

miRNA的异常导致了OSCC肿瘤的发生[4]。为了进一步筛选口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA,本研究利用qRT-PCR技术检测OSCC患者外周血中miRNA的变化,进一步扩大样本量进行验证,并分析miRNA与OSCC患者临床病理指标和预后的关系。

1、对象与方法

1.1研究对象

正常对照组的血液样本取自石家庄市常住人口的志愿者;实验组的血液样本取自2014年5～12月于河北医科大学第四医院口腔科就诊的口腔颌面部鳞状细胞癌患者。其中实验组患者未进行任何特殊治疗且均有病理学诊断依据,并且排除其它系统肿瘤或和口腔转移性肿瘤的情况。正常志愿者血液样本3例,口腔颌面部鳞状细胞患者血液样本63例。所有志愿者和患者均签署知情同意书,并获得河北医科大学第四医院伦理委员会的批准。于清晨空腹抽外周静脉血2 mL,予抗凝处理,-80℃保存。

1.2血清总RNA提取及反转录

用miRNeasy Serum/plasma Kit血液总RNA提取试剂盒(QIAGE)提取总RNA,利用miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control(QIAGE)进行总RNA纯化,置于-80℃保存。ND-2000超微量分光光度计检测标本浓度,根据A值的比值:A260∶A280检测总RNA的纯度,该值在1.8～2.0之间表明总RNA纯度较高,符合要求。按照反转录试剂盒(miScript II RT Kit,QIAGE)的说明书进行总RNA的逆转录以用于后续实验。

1.3 miRNA微阵列检测及结果判定

血清与血浆miRNA PCR芯片Serum & Plasma miScript miRNA Array购自德国QIAGE公司。qRT-PCR反应体系的配制:2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix 1375μL,10×miScript Universeral primer 275μL,Template cDNA 100 L,加Nuclease-Free Water至总体积2750μL。充分混匀,于96孔板中每孔加入25μL。进行qRT-PCR扩增,反应条件为:95℃15 min预变性,94℃15 s变性,55℃30 s退火,70℃30 s延伸,变性至延伸过程共40循环。miRNA的相对表达量用2-△△Ct(Fold Change值)来表示,其中C.39作为内参。实验重复3次,结果取平均值。Fold Change大于2表明实验组中miRNA表达水平较对照组的上调且有意义。Fold Change小于0.5表明实验组中miRNA表达水平较对照组的下调且有意义。

1.4实时定量PCR验证基因芯片的结果

外周血按照上述方法提取血清总RNA及反转录,引物采用10×miScript Primer Assay(德国QIAGE公司)。反应体系为25μL,其中包括12.5μL 2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix,2.5μL 10×miScript Universeral Primer,2.5μL 10×miScript Primer Assay,2.5μL Template cDNA,加Nuclease-Free Water至总体积25μL。充分混匀,进行qRT-PCR扩增,反应条件如上所述。miRNA的相对表达量用2-△△Ct(Fold Change值)来表示,其中C.39作为内参。实验重复3次,结果取平均值。高于平均值的miRNA定义为高表达。

1.5统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件,计量资料以x¯±s表示,组间比较采用t检验,组内比较采用方差分析,应用Kaplan-Meier方法对OSCC患者是否阳性表达miR-222-3p、miR-423-5p进行生存分析,应用Cox回归模型针对miR-222-3p、miR-423-5p及临床病理资料进行单因素和多因素分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1提取样本总RNA纯度较高

A260∶A280检测总RNA的纯度,该值在1.8～2.0为适宜,表明总RNA纯度符合要求。实验组与对照组各样本总RNA的A260∶A280均在这个范围内(表1),表明各样本总RNA的纯度较高,无明显的蛋白质污染,可用于进一步实验。

表1实验组与对照组RNA质检结果

2.2OSCC患者外周血中miRNA差异表达情况

采用Serum & Plasma miScript miRNA Array检测OSCC外周血中miRNA差异表达情况。总共检测了84种miRNA,其中OSCC外周血中上调大于2倍的miRNA有8个(表2),分别为miR-122,miR-222,miR-223,miR-133b,miR-10a,miR-148a,miR-21和miR-92a;上调倍数为2.4544到6.8812不等。下调小于0.5倍的miRNA有18个(表2),分别为miR-221,miR-122,miR-26a,miR-23a,miR-25,miR-27a,miR-423,miR-93,let-7c,miR-130b,miR-26b,miR-191,miR-103a,miR-15b,miR-16和miR-22;下调倍数为0.2343到0.4961不等。

表2 OSCC患者外周血中显著变化的miRNA

2.3qRT-PCR验证芯片结果的准确性

根据芯片检测结果,剔除研究相对成熟的miRNA,从筛选出的26个差异性表达的miRNA中选hsa-miR-222-3p(miR-222-3p),hsa-miR-423-5p(miR-423-5p)进行验证。应用qRT-PCR检测60例OSCC外周血中miR-222-3p和miR-423-5p的表达水平,进一步验证芯片结果的准确性。结果显示,60例OSCC外周血中miR-222-3p表达水平平均值为5.592±0.141显著低于健康志愿者的0.987±0.149,P<0.05。

60例OSCC外周血中miR-423-5p表达水平平均值为0.434±0.127显著低于健康志愿者的1.112±0.164(P<0.05)。结果提示,OSCC外周血的miR-423-5p表达水平较正常组中的表达水平明显降低。

2.4 miR-222-3p和miR-423-5p可作为OSCC患者的潜在预后指标

统计分析(表3)显示,miR-222-3p在外周血的表达与OSCC的性别(P=0.592)、年龄(P=0.390)、组织学分级(P=0.165)均无相关性,但与pTNM分期(P=0.000)和淋巴结转移(P=0.001)呈正相关。miR-423-5p在外周血的表达与OSCC的性别(P=0.554)、年龄(P=0.437)、组织学分级(P=0.387)均无相关性,但与pTNM分期(P=0.000)和淋巴结转移(P=0.000)呈正相关。

表3 OSCC患者外周血中miRNA-222-3p和miRNA-425-5p表达水平与患者临床病理特征之间的关系

对miR-222-3p和miR-423-5p高表达及低表达的患者生存曲线分别进行Log-Rank检验,结果显示,miR-222-3p高表达的生存期显著低于低表达的患者(P<0.001,图1a);miR-423-5p低表达的生存期显著低于高表达的患者(P<0.001,图1b)。

单因素分析结果提示,仅有miR-222-3p表达(P=0.001)、miR-423-5p表达(P=0.007)、pTNM分期(P=0.007)和淋巴结转移(P=0.038)可进入回归模型进一步分析。然而TNM分期包括淋巴结转移,并非独立因素,故仅淋巴结转移进入回归模型分析。多因素分析结果提示miR-222-3p表达(P=0.019)可作为OSCC患者生存的独立预后因素(表4)。

表4影响OSCC患者5年生存率预后因素的单因素及多因素分析

图1应用Kaplan-Meier方法对OSCC患者进行生存分析

3、讨论

miRNAs在多种肿瘤中异常表达[4,5]。研究发现,在OSCC患者血清中miR-626,miR-5100和miR-196a/b等存在不同程度表达[4,6]。而OSCC中的miRNA表达谱尚不明确,在本研究中,通过qRT-PCR技术检测OSCC患者外周血中miRNA的变化,以期筛选出OSCC的miRNA表达谱。

本文首次通过qRT-PCR技术检测OSCC患者外周血中miRNA的变化,一共检测了84个miRNA,其中26个miRNA表达存在变化。剔除研究相对成熟的miRNA,选出miR-222-3p,miR-423-5p应用qRT-PCR检测其在60例OSCC外周血中的表达水平。结果显示,OSCC外周血的miR-222-3p表达水平较对照组明显升高,而miR-423-5p表达水平较对照组中明显降低。

有研究显示,乳腺癌[7]、卵巢癌[8]等恶性肿瘤中miR-222-3p的表达与临床病理指标间存在着密切关系。先前的研究表明,在40%的OSCC组织中发现miR-222表达增加,并与肿瘤生长相关[9]。本研究同样分析了miR-222-3p和miR-423-5p的表达水平与OSCC临床病理指标之间的关系。结果显示,miR-222-3p的高表达和miR-423-5p的低表达均与pTNM分期和淋巴结转移密切相关,提示miR-222-3p和miR-423-5p可能可预测OSCC患者的预后不良。这与先前的研究结果相一致[7,8];而miR-423-5p多作为心脏衰竭的循环分子标志物进行研究[10],现有研究结果提示miR-423-5p与卵巢癌组织学分级呈负相关[11],在OSCC中尚无相关研究。

pTNM分期和淋巴结转移均与患者预后密切相关,本研究应用Kaplan-Meier方法进行生存分析,结果提示miR-222-3p高表达和miR-423-5p低表达均与OSCC患者的总体生存率呈负相关,提示上述指标可提示OSCC预后不良。多因素分析模型进一步提示,miR-222-3p高表达是OSCC患者的独立预后因素。Wang等的研究显示,miR-222-3p可能是乳腺癌诊断和预后的标志物[7]。卵巢癌患者肿瘤组织和血浆中的miR-423-5p表达与转移和肿瘤进展呈负相关,可能预示较好的预后[11]。然而外周血易于采集且患者具有较好的依从性,外周血检测miRNA的变化可以早期诊断OSCC和病情评估。

综上所述,本研究利用qRT-PCR技术检测OSCC患者外周血中miRNA的变化,并进行了验证。通过扩大样本量并阅读相关文献证实了本次筛选结果的正确性,本课题组将在肿瘤组织中进一步验证,并深入研究miRNA的靶基因及其生物学功能,进一步阐明OSCC中miRNA的作用机制,为OSCC的早期诊断提供理想的生物标记物。

参考文献：

[2]王丽萍,郭雪琪,闫勇勇,等.miR-146a在口腔鳞癌组织及细胞中的表达及功能研究[J].口腔医学研究,2017,33(11):1204-1208.

杨凯成,杨蕾,赵建广,罗风玉,陈彦平,崔子峰,陈赫,满莎莎.口腔鳞状细胞癌患者外周血microRNA的表达及预后意义[J].口腔医学研究,2020,36(05):428-432.

基金:河北省卫生厅青年科技课题(编号:20190728)