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D-柠檬烯抑制NF-κB通路介导COPD小鼠的炎症和免疫反应

2024-11-27 58 上传者：管理员

摘要：为探讨泻肺清肝饮活性成分D-柠檬烯对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)小鼠炎症和免疫反应的影响及其机制，将36只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组：对照组、模型组和D-柠檬烯组，每组12只。通过LPS和烟熏诱导COPD小鼠模型，D-柠檬烯组小鼠从造模第2天开始每天按照100 mg/kg的剂量给予腹腔注射D-柠檬烯，持续给药至第28天。观察各组小鼠的毛发、行动以及精神状态，并记录小鼠体质量，H-E染色观察小鼠肺组织病理变化，Western blotting检测小鼠肺组织中NF-κB、 p-NF-κB蛋白的表达，ELISA检测血清以及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-6、 TNF-α、 IL-1β和IL-10的水平，FACS检测外周血中Th17/Treg比值。结果显示，与对照组比较，模型组小鼠体质量减轻，精神萎靡颓废，毛色暗淡，脱毛，活动度降低；肺泡结构紊乱，支气管壁上皮增生，肺组织周围有大量炎症细胞浸润；肺组织中p-NF-κB蛋白表达水平，血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β水平和外周血中Th17/Treg比值均显著升高(P<0.01),血清及BALF中IL-10水平显著降低(P<0.01)。D-柠檬烯用药后显著逆转了上述变化(P<0.01)。该研究提示，D-柠檬烯通过抑制NF-κB通路来恢复Th17/Treg平衡，降低炎性因子的表达，对COPD小鼠具有较好的治疗效果。

关键词：
COPD
D-柠檬烯
慢性阻塞性肺疾病
核因子κB通路
炎症反应
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慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的呼吸系统疾病[1]。近年来，发病率和死亡率急剧上升的COPD严重影响了患者的生活质量[2]。研究表明， COPD与慢性炎症相关，主要影响肺实质和周围呼吸道，从而导致很大程度上不可逆和逐步的气流受限[3-4]。 NF-κB是公认的炎症和免疫反应调节因子[5], 研究表明，通过药物抑制COPD小鼠NF-κB信号转导可以起到减轻气道炎症的作用[6], 可见NF-κB是COPD中一个重要的信号通路。泻肺清肝饮是一种多年临床经验方，具有泻肺化痰、清肝止咳、息风平喘的功效[7]。D-柠檬烯是泻肺清肝饮中君药青皮的主要活性成分，研究发现，D-柠檬烯可通过调节NF-κB来抑制炎症[8], 但D-柠檬烯对COPD的作用尚未见报道。因此，本研究通过构建COPD小鼠模型，评估D-柠檬烯对小鼠肺组织炎症反应的影响，以进一步揭示泻肺清肝饮对COPD的调控机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

实验动物来源于三峡大学动物实验中心，6周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠共36只，体质量17～19 g, 饲养于武汉华联科生物技术有限公司SPF动物房。适应性喂养7 d后开始实验。饲养温度(22±2)℃, 相对湿度50%～60%, 人工光照明暗各12 h, 给予充足的食物和水。实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2018-0104。

1.2 试剂与仪器

佛波酯购自Sigma公司； LPS、D-柠檬烯购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；香烟(软精品)购自红金龙有限公司；伊红、中性树脂、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒、钙离子霉素、莫能菌素钠购自北京索莱宝科技有限公司；苏木精购自武汉赛维尔生物科技有限公司； NF-κB抗体、 GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗兔抗体购自武汉贝茵莱生物科技有限公司； p-NF-κB抗体购自Abcam公司；抗CD4、叉头状螺旋转录因子3(forkhead box protein 3, Foxp3)、 CD25、 IL-17抗体购自eBioscience公司；固定破核剂购自BD bioscience公司。BX53型正置显微镜和IX71倒置荧光显微镜购自Olympus公司； Accuri C6流式细胞仪购自BD公司； Multi-skan GO型全波长酶标仪购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 COPD模型的构建及鉴定

分别于造模的第1 天和第14 天在小鼠鼻腔内滴注10 μg的LPS(溶于30 μL的PBS中); 第2～28天烟熏，将小鼠置于50 cm×30 cm×30 cm的玻璃箱中，玻璃箱内放置燃烧的香烟，每次暴露30 min, 每天2次[9]。用H-E染色鉴定造模是否成功。

1.3.2 动物分组及处理

将小鼠随机分为对照组、模型组和D-柠檬烯组，每组12只。模型组和D-柠檬烯组构建COPD模型，D-柠檬烯组从造模第2 天开始每天按照100 mg/kg的剂量给予腹腔注射D-柠檬烯，持续给药至第28 天[10]; 对照组和模型组从造模第2天开始同期给予等量的生理盐水。每周记录2次小鼠的体质量，并观察小鼠的毛发状态、行动情况以及精神状态。最后一次给药结束后24 h处死小鼠，取肺组织进行病理和分子检测，取小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF), 离心后保留前3次BALF的上清液进行ELISA和FACS检测。麻醉并处死小鼠，从腹主动脉中收集全血进行ELISA检测。

1.3.3 H-E染色观察小鼠肺组织的病理变化

将固定好的小鼠肺组织取横切面，石蜡包埋后进行切片，厚度约为3 μm, 水浴展片后及时烤片，按照H-E染色法的步骤进行染色，在显微镜下观察小鼠肺组织的病理变化及炎症情况。

1.3.4 Western blotting检测各组小鼠肺组织中NF-κB、 p-NF-κB蛋白的表达

肺组织剪碎充分裂解后进行蛋白质定量检测，根据定量结果上样电泳，每孔上样量为20 μg蛋白质，电泳结束后湿转至PVDF膜，用5 %脱脂奶粉室温封闭， 4 ℃过夜，加入一抗稀释到所需浓度后室温孵育1 h, 洗膜3次后加入二抗稀释液，与膜室温孵育1 h, 洗膜3次后进行ECL检测，利用Tanon GIS软件读取条带的灰度值。

1.3.5 ELISA检测血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β和IL-10的表达

严格按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β和IL-10的表达水平。

1.3.6 FACS检测外周血中Th17/Treg的比例

分离小鼠PBMC进行FACS检测。 Th17比例测定：用1 mL的细胞培养液重悬细胞，加入2 μL佛波酯(终浓度为50 ng/mL)、钙离子霉素(终浓度为2 μg/mL)和莫能菌素钠(终浓度约3 μg/mL), 在37 ℃、 5% CO2培养箱中共培养6 h, PBS洗涤后加入2 mL流式染色缓冲液洗涤， 100 μL流式缓冲液重悬细胞，加入2 μL CD4, 4 ℃避光孵育30 min, 按照固定/破膜试剂盒说明书进行固定， PBS洗涤后加入2 μL IL-17抗体， 4 ℃避光孵育45 min; 400 μL PBS重悬细胞， 4 ℃避光保存，上机检测。 Treg比例测定：用100 μL PBS重悬细胞，加入2 μL CD4和CD25抗体， 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗涤后按照固定/破膜试剂盒说明书进行固定， PBS洗涤后加入2 μL Foxp3抗体，避光孵育45 min, 400 μL PBS重悬细胞， 4 ℃避光保存，上机检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，定量资料以

表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准(α)为0.05。

2、结果

2.1 模型鉴定

H-E染色观察COPD模型造模是否成功，结果显示，对照组小鼠肺组织正常，无炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组小鼠肺组织内有大量炎症细胞浸润，肺泡壁破损严重，这表明模型构建成功。详见图1。

图1 COPD模型鉴定(H-E染色， ×200)

2.2 D-柠檬烯对小鼠一般状况的影响

对照组小鼠精神状态和活动状况均正常，毛发顺滑光亮。开始烟熏后，模型组个别小鼠出现精神萎靡、毛色暗淡、轻微脱毛、活动度降低的情况，且随着烟熏时间的延长，出现上述情况的小鼠增多；第2次滴鼻后，个别小鼠出现精神倦怠、活动力低下、毛发糟乱、脱毛严重，甚至部分皮肤裸露的情况，且烟熏时间越长，出现上述情况的小鼠越多。与模型组比较，D-柠檬烯组小鼠出现精神萎靡、毛色暗淡、轻微脱毛、活动度降低情况的小鼠明显减少，且未出现精神倦怠和部分皮肤裸露的情况。与对照组比较，模型组小鼠体质量减轻最多，而D-柠檬烯组小鼠体质量较模型组有所增加(图2)。整个实验过程没有小鼠死亡。

图2 各组小鼠体质量变化情况

2.3 D-柠檬烯对小鼠肺组织病理的影响

H-E染色结果显示，对照组小鼠肺组织结构正常、完整，无炎症细胞浸润；模型组小鼠肺泡结构紊乱，平滑肌层增厚，肺组织周围有大量炎症细胞浸润，支气管壁上皮增生；与模型组比较，D-柠檬烯组小鼠肺泡结构基本完整，肺组织周围炎症细胞的数量明显减少，支气管壁上皮和平滑肌层偶见异常。详见图3。

2.4 D-柠檬烯对小鼠肺组织中NF-κB、 p-NF-κB蛋白表达的影响

Western blotting检测小鼠肺组织中NF-κB、 p-NF-κB蛋白的表达，结果显示，与对照组比较，模型组小鼠p-NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01); 与模型组比较，D-柠檬烯组小鼠p-NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。详见图4。

图3 各组小鼠肺组织H-E染色结果(×200)

图4 各组小鼠肺组织中NF-κB、 p-NF-κB蛋白表达水平的比较

2.5 D-柠檬烯对小鼠血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β和IL-10水平的影响

ELISA检测各组小鼠血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β和IL-10的水平，结果显示，与对照组比较，模型组小鼠血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β水平均显著升高(P<0.01), IL-10水平显著降低(P<0.01); 与模型组比较，D-柠檬烯组小鼠血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β水平均显著降低(P<0.01), IL-10 水平显著升高(P<0.01)。详见图5。

图5 各组小鼠血清及BALF中IL-6、 TNF-α、 IL-1β和IL-10水平的比较

2.6 D-柠檬烯对小鼠外周血中Th17和Treg的影响

FACS检测小鼠外周血中Th17和Treg的比例，并比较Th17/Treg比值，结果显示，与对照组比较，模型组小鼠外周血中Th17比例显著增加(P<0.01), Treg比例显著减少(P<0.01), Th17/Treg比值显著升高(P<0.01); 与模型组比较，D-柠檬烯组小鼠外周血中Th17比例显著减少(P<0.01), Treg比例显著增加(P<0.01), Th17/Treg比值显著降低(P<0.01)。详见图6。

图6 各组小鼠外周血中Th17、 Treg比例及Th17/Treg比值的比较

3、讨论

研究表明，泻肺清肝饮活性成分D-柠檬烯具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用[11]。本研究使用D-柠檬烯治疗COPD模型小鼠，通过观察小鼠行为学和肺组织切片的病理情况发现，D-柠檬烯对COPD模型小鼠具有较好的治疗效果，能够改善小鼠的精神状态和活动状况，减轻肺组织的损伤并减少炎症细胞的浸润。

慢性气道炎症和进行性肺功能下降被认为是COPD的2个主要特点，反复的气道炎症会引起COPD患者气道重构和进行性气道堵塞[12]。研究表明，多种炎症细胞及细胞因子参与COPD的发生和发展， COPD患者肺实质和周围呼吸道中的肺泡巨噬细胞、嗜中性粒细胞、 T细胞和从循环中募集的ILC数量增加，这些炎症细胞和包括上皮细胞、内皮细胞以及成纤维细胞在内的结构细胞能够分泌多种促炎介质，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和脂质介质等[13]。 Th17和Treg都是由CD4+T细胞分化而来的，研究认为Th17/Treg的失衡与COPD的发生和发展有着密切的联系[14]。 Th17能够分泌IL-17, IL-17与其受体结合后能够促进IL-1β和IL-6等炎性因子的释放，促进气道炎症反应的发生和发展，加快COPD的进展[15]。 Treg主要通过分泌TGF-β、 IL-10和IL-35等抗炎因子来抑制免疫细胞的活性，减轻过度炎症反应引起的组织损伤，发挥免疫调节的作用[16]。本研究结果显示， COPD模型小鼠外周血中Th17比例增加， Treg比例减少，血清及BALF中促炎因子IL-6、 TNF-α和IL-1β水平升高，抗炎因子IL-10水平降低，而经D-柠檬烯治疗后COPD模型小鼠外周血中Th17比例减少， Treg比例增加，血清及BALF中炎性因子IL-6、 TNF-α和IL-1β水平均降低， IL-10水平升高，这些结果提示D-柠檬烯能够通过调节Th17、 Treg比例来调控促炎和抗炎因子的释放，缓解COPD中的炎症反应。

NF-κB在细胞炎症反应和免疫反应过程中发挥关键作用， NF-κB的异常激活会引起慢性炎症和自身免疫性疾病等[17]。 NF-κB通路有众多的激活因子， IL-6、 IL-8、 IL-1β、 TNF-α等炎性因子，趋化因子及黏附分子等均能够激活NF-κB通路， NF-κB活化后又诱导大量炎性因子释放，促进炎症细胞的浸润，加重组织损伤[18-19]。研究表明， NF-κB参与COPD的气道炎症反应，抑制NF-κB能够减轻COPD气道炎症[20]。本研究结果显示， COPD模型小鼠肺组织中p-NF-κB的表达显著升高，D-柠檬烯治疗后p-NF-κB的表达显著降低，这表明D-柠檬烯能够通过抑制NF-κB通路的激活减轻COPD气道炎症和免疫反应。

综上所述，泻肺清肝饮活性成分D-柠檬烯能够通过抑制NF-κB通路的激活来调节Th17/Treg紊乱和炎性因子的释放，从而缓解COPD模型小鼠的炎症和免疫反应。

参考文献:

[7]张军,鲁焱,李旭成,等.泻肺清肝饮治疗哮喘热哮证的临床研究[J].辽宁中医杂志,2014,41(10):2154-2157.

基金资助:第六批全国老中医药专家学术经验继承工作项目[国中医药人教发(2017)29号]; 湖北省卫生健康委员会中医药科研项目(ZY2021Q013);

文章来源:张军,舒婷婷,李汉永,等.D-柠檬烯抑制NF-κB通路介导COPD小鼠的炎症和免疫反应[J].现代免疫学,2024,44(06):494-499.