急性脑梗死(ACI)以突然发病、迅速出现局限性或弥散性中枢神经系统功能障碍为主要特征，约占全部脑卒中患者的70%～80%,由于脑卒中产生极高的致残率和致死率，给家庭和社会造成沉重负担[1]。尽管目前关于缺血性脑卒中病变的研究已取得重大进步，诸如C反应蛋白、白细胞介素类、S-100B蛋白类、神经元特异性烯醇酶以及胶质纤维酸性蛋白等脑缺血损伤性血清标志物逐渐被发现[2]。但目前仍缺乏像用肌钙蛋白检测心肌梗死这种灵敏性特强的生物学标志物来检测缺血性脑卒中。因此，寻找一个快速、方便、经济的血清标志物，用于ACI的诊断、指导治疗和评估病情，已成为研究热点。微小RNA(microRNAs,miRNAs)对基因的表达起着调控的作用，在细胞的所有生物学过程均起到重要的调控作用[3,4]。

目前已有研究[5]表明，ACI患者外周血中多种miRNAs的水平都有不同程度的表达异常，且与病情的严重程度具有一定相关性，提示miRNAs参与ACI的病理生理学过程。在大鼠脑缺血-再灌注损伤动物模型研究中发现，miR-34c通过抑制炎症反应，对损伤的神经细胞及组织具有较好的保护作用[6]。在小鼠慢性损伤所致神经痛的模型中，miR-34c也被发现能抑制炎症反应及炎性因子的产生并缓解神经痛的作用[7]。炎症反应是ACI的重要病理机制之一，参与脑梗死的发生发展过程，尤其在早期阶段的作用更加突出[8]。以往关于miR-34c的研究，主要集中在内分泌疾病、恶性肿瘤方面，在ACI中的研究却少有报道，本研究旨在测定急性脑梗死血清中miR-34c的表达量，并分析其与相关炎性因子及NIHSS评分之间的关系，以研究miR-34c对ACI疾病的诊断价值和在评估神经缺损程度的临床价值。现报道如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月至2021年1月蚌埠医学院第一附属医院神经内科收治的ACI患者122例为梗死组；其中男性68例(55.74%),女性54例(44.26%),年龄40～80岁，平均(66.74±4.95)岁，高血压病84例(68.85%),高脂血症22例(18.03%),冠心病19例(15.57%),糖尿病24例(19.67%),吸烟者50例(40.98%),饮酒者48例(39.34%);梗死组患者入院时根据美国国立卫生研究院卒中量表(nationalinstitutesofhealthstrokescale,NIHSS)评分[9]进行病情严重程度分组，分为轻度组(<4分)46例、中度组(4～15分)50例和重度组(≥16分)26例。另外选取同期在本院体检的无急性脑梗死者40例为对照组，男性17例(42.50%),女性23例(57.50%),年龄42～78岁，平均(65.11±4.73)岁，高血压病24例(60.00%),高脂血症7例(17.50%),冠心病8例(20.00%),糖尿病5例(12.50%),吸烟者12例(30.00%),饮酒者18例(45.00%)。两组对象一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

1.2 梗死组纳入与排除标准

纳入标准：①ACI诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[10]中的ACI诊断标准，且经颅脑磁共振成像证实与神经功能缺损症状相符合的新发梗死灶；②患者发病72h内；③临床资料完整；④年龄40～80岁。排除标准：①脑出血患者；②不配合检查者或者昏迷患者；③合并心、肺功能不全者；④合并免疫性疾病或者感染性疾病者；⑤给予急诊溶栓的患者；⑥合并心房颤动者；⑦临床资料不全的患者。本研究设计通过医院伦理学委员会审核批准(伦科批字[2021]第168号),所有对象均签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集

收集所有研究对象一般资料，包括年龄、性别，高血压、高脂血症、冠心病、糖尿病、吸烟史及饮酒史等。

1.3.2 血清炎性因子检测

采集梗死组入院次日及对照组体检当日清晨空腹静脉血4～5mL,室温下静置50～60min,待自然凝固后，以2000r/min速度离心20min,取上清液后储存于-80℃冰箱里统一待检。采用酶联免疫吸附试验法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)测定血清白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)水平。将待测样品和不同浓度的标准加入预先涂有相关捕获抗体的孔中，培养1h并洗涤5次，然后添加底物并在37℃下培养15min。最后，加入停止缓冲液，充分混合，测量吸光度。每次试验反复三遍，每个过程都严格遵照试剂盒说明书实施。所有试剂盒均购自上海桑尼生物科技有限公司。

1.3.3 血清miR-34c水平检测

采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测两组血清中miR-34c表达水平，严格按照试剂盒相关操作步骤进行检测，每份标本重复进行PCR试验3次，最终取3次平均值。miR-34c茎环引物购自锐博生物科技有限公司，U6内参引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，基因相对表达量用2-△△Ct法进行分析。U6上游引物：正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物：5’-ACGCTTCACGAATTTGCG-3’;miRNA-34c正向引物：5’-AGTTACTAGGCAGTGTAGT-3’,反向引物：5’-TCTTTTTACCTGGCCGTGTG-3’。

1.4 观察指标

①收集并比较梗死组与对照组两组对象一般资料，包括年龄、性别、高血压病、高脂血症、冠心病、糖尿病、吸烟史及饮酒史。②记录梗死组患者入院时NIHSS评分并分为轻度组、中度组及重度组，同时检测梗死组与对照组两组血清miR-34c、IL-6、TNF-α及CRP表达水平并进行比较。③分析梗死组患者血清miR-34c与IL-6、TNF-α、CRP及NIHSS评分的相关性。④利用受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线评估miR-34c对ACI的诊断价值。

1.5 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件对所有研究数据进行分析，正态分布计量资料以x¯±s进行表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验；相关性分析采用Pearson分析，以P<0.05为差异有统计学意义；采用ROC曲线分析血清miR-34c水平对ACI的诊断价值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 梗死组与对照组血清miR-34c、IL-6、TNF-α及CRP表达水平比较

与对照组相比，梗死组血清中miR-34c表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05);梗死组血清IL-6、TNF-α及CRP表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 不同病情严重程度ACI患者血清miR-34c、IL-6、TNF-α及CRP表达水平比较

中、重度组血清miR-34c水平低于轻度组，差异有统计学意义(P<0.05);且中、重度组血清IL-6、TNF-α及CRP水平高于轻度组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3 梗死组血清miR-34c水平与炎性因子及NIHSS评分之间的相关性

梗死组血清miR-34c表达水平与IL-6、TNF-α、CRP及NIHSS评分之间均呈负相关(P<0.05)。见表4。

2.4 ACI患者血清miR-34c的水平对急性脑梗死的诊断价值

以miR-34c作为检验变量，是否诊断ACI作为状态变量绘制ROC曲线。结果显示：曲线下面积(areaunderthecure,AUC)为0.918(95%CI:0.865～0.971),约登指数为0.711。以ROC曲线靠左上方约登指数的最大切点作为最佳临界值，最佳截断值为0.868,灵敏度及特异度分别为89.015%、82.131%。见图1。

3、讨论

急性脑梗死的病理基础是动脉粥样硬化，是一种长期慢性炎症性过程[11]。动脉闭塞后，坏死的神经细胞及组织可释放损伤相关分子模式(DAMPs),激活促炎细胞、释放炎性因子，从而引发一系列炎症级联反应导致脑组织进一步损伤[12,13]。miRNAs是一种大约由20～24个核苷酸组成的单链非编码RNA分子，其能与靶基因mRNA结合参与调控基因转录后水平的表达[14]。研究[15]发现，正常情况下，人体血液中的miRNAs因具有RNA酶耐受性能稳定的存在外周血液中；因此外周血中miRNAs表达异常对于疾病的诊断具有一定的指导意义[16]。新近研究[17,18]发现，急性缺血性脑卒中可引起外周血中miRNAs异常表达，提示miRNAs参与大脑缺血、缺氧性坏死的病理变化过程。

本研究发现，ACI患者血中miR-34c的水平低于对照组，且随着病情严重程度的增加，miR-34c的表达水平出现逐渐下降趋势，这表明miR-34c可能在ACI的病理生理过程中发挥重要作用。ROC曲线下面积为0.918,灵敏度为89.015%,特异度为82.131%,截断值0.868;同时，miR-34c和NIHSS评分之间呈负性关系；上述研究结果表明，miR-34c不仅对ACI具有良好的诊断价值，同时也表明对于评估急性脑梗死的严重程度具有重要价值；提示miR-34c与ACI的诊断及病情评估密切相关，参与ACI的发生及进展过程。

ACI的发生发展过程与神经炎症反应产生的炎性递质与细胞因子密切相关[19]。参与ACI发病过程的细胞因子中最常见且最重要的为IL-6、IL-8、TNF-α及CRP等，在脑梗死急性期核因子-κB是许多炎症因子的转录因子[20],核因子-κB被激活后产生大量的IL-6、IL-8、TNF-α及CRP聚集在梗死灶及周围缺血半暗带区，通过炎症级联反应使脑组织损伤进一步加重，病情相应随之加重[21]。本研究结果提示，ACI患者血清中IL-6、TNF-α及CRP表达水平均高于对照组，且随着病情加重而升高。表明IL-6、TNF-α及CRP参与急性脑梗死的发生并可能起着促炎作用使患者病情加重。

有研究[22]表明，miRNAs参与调节炎性细胞和炎性介质的表达。在大鼠脑缺血缺氧损伤的实验模型中，miR-34c通过抑制炎症反应，可使大鼠的神经功能缺损评分、脑水肿、炎症和神经元损伤明显缓解或者减轻[23]。在本研究中，miR-34c与相关炎性因子IL-6、TNF和CRP均呈负相关，表明miR-34c可能通过抑制炎症反应参与ACI的病理过程。miR-34c与炎性因子之间的相互作用可能通过抑制某种炎症信号通路来介导。miRNA在ACI早期阶段就参与并启动了与急性脑梗死相关的信号和免疫功能调节通路，核因子-κB在脑损伤中起关键作用，被认为是脑缺血损伤后炎症级联反应的起始因子。miR-34c通过调控核受体辅激活蛋白1的表达抑制核因子-κB的活性，进而抑制炎性因子的生成减轻炎症反应[24]。miR-34c通过靶向Toll样受体7抑制核因子-κB/丝裂原活化蛋白激酶通路的表达来抑制炎性细胞因子的生成；以上炎性通路表明miR-34c对受损的神经细胞和组织有保护作用[22];另外Xu等[7]在小鼠慢性坐骨神经损伤模型中发现，miR-34c可能通过抑制含NLR家族PYRIN域蛋白3介导的神经炎症通路而抑制IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的表达，最终来抑制神经炎性反应来缓解疼痛。随着对分子生物学技术的进一步研究，miR-34c与炎性因子之间的相互作用将会被进一步阐明解释。

综上所述，ACI患者miR-34c表达下降，可作为诊断ACI的血清学标记物，评估神经功能缺损程度，同时可能作为急性脑梗死一种潜在生物学标志物对ACI治疗提供新的线索。由于本研究样本数量较少，且未能动态检测各项指标的变化，研究结果可能存在偏差，因此在后续的研究中，将进一步扩大样本量，把脑梗死进行TOAST分型及进行临床预后随访，同时深入到细胞分子水平进一步研究miR-34c调节炎症反应的机制，从而为治疗ACI患者提供新的可靠的依据。

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文章来源：梁磊,赵跃华,骆嵩,许力.急性脑梗死患者外周血miR-34c的表达情况及临床意义[J].安徽医学,2022,43(06):629-633.