阿尔茨海默病（AD）是继心脏病、脑卒中、肿瘤、慢性阻塞性肺疾病之后严重威胁老年人健康的重大疾病。根据《世界阿尔茨海默病2018年报告》显示，全球AD患者约有5千万，我国65岁以上的老年人群中AD患病率高达3.21%。近年来，围绕β淀粉样蛋白（Aβ）为靶点的新药研发陆续以失败告终。因此，探索AD的发病机制，寻求有效的防治手段，对改善患者生活质量、减轻家庭及社会负担具有重要的现实意义。

线粒体功能障碍、突触数目减少、神经元损伤是AD认知障碍重要的神经病理学基础。Aβ引起线粒体结构损伤及功能下降，导致神经元能量代谢障碍。同时，Aβ诱导突触可塑性抑制，AD相关的突触数量减少，突触可塑性相关蛋白如突触素（SYP），突触后致密物-95(PSD-95），脑源性神经营养因子（BDNF）水平降低，突触间隙增大，突触结构模糊不清，突触效能下降，是学习记忆障碍的重要因素，其损伤程度与AD认知障碍呈正相关。另外，Aβ在聚集过程中引起氧自由基生成过多，抗氧化酶活性下降，蛋白质、脂质过氧化，影响线粒体功能，进而诱导神经元突触丢失。因此，通过改善线粒体及突触功能，减轻神经元损伤，将是防治AD的有效措施。

近年来，中药及有效成分通过调节突触功能、保护线粒体、发挥抗AD作用逐步得到验证。开心散出自唐代孙思邈《备急千金要方·卷十四》，由人参、茯苓、石菖蒲、远志组成，具有化痰开窍，健脾宁心，益智安神的功效，主要用于治疗抑郁、痴呆、焦虑、失眠等病证[16]。研究发现，开心散促进突触前膜突触蛋白1(SYN1）磷酸化、增加皮质及海马区PSD-95阳性蛋白表达，促进长时程增强，增加突触可塑性，减轻海马神经元凋亡[18]。开心散通过调节Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap-1）/核因子E2相关因子2(Nrf2）/锰超氧化物歧化酶（MnSOD）信号通路，缓解Aβ1-42诱导的AD大鼠认知障碍[19]。课题组前期运用网络药理学预测开心散治疗AD的有效活性成分和潜在作用靶点及通路，并证实开心散可减轻东莨菪碱诱导的学习记忆障碍、减轻神经炎症[20,21]。目前，开心散提高学习记忆能力、改善神经突触功能在APP/PS1动物模型方面的研究较少，其潜在的保护机制尚不明确。因此，本研究拟运用APP/PS1小鼠作为AD动物模型，探讨开心散对APP/PS1小鼠的神经突触保护作用及潜在机制，以期为AD的治疗提供新的理论依据。

1、材料

1.1动物

72只8月龄SPF级雄性APP/PS1双转基因小鼠、同窝野生型小鼠均购自广东省医学实验动物中心，体质量（28±2)g，动物合格证号SCXK（粤）2018-0002。动物饲养于河南中医药大学动物实验中心SPF动物实验室，温度23～25℃，相对湿度50%～60%，单笼饲养，自由获取食物和水。动物实验方案经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准号DWLL202003147。

1.2药物与试剂

开心散由人参片（吉林/禹州市凯旋药业有限公司，批号190802），茯苓（安徽/安国市远光药业有限公司，批号045200303），石菖蒲（湖南/安国润德药业有限公司，批号C20053007），远志（山西/安国市远光药业有限公司，批号494191101）组成，所有中药饮片均购于河南省顺康仓储服务有限公司，经河南中医药大学第一附属医院中药房赵娅主管药师鉴定均为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》规范；多奈哌齐片（卫材药业有限公司，批号2012045）购于河南中医药大学第一附属医院；活性氧（ROS），丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），乙酰胆碱（ACh），乙酰胆碱转移酶（ChAT），乙酰胆碱酯酶（AChE）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号分别为20201015,20201017,20201016,20201014,20201016,20201016,20201017）；总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，批号分别为DP425,ER107-02];SYBRGreenPCRMasterMix（美国ThermoFisherScientific公司，批号4309155）。

1.3仪器

WMT-100型Morris水迷宫视频分析系统（成都泰盟科技有限公司）；Microfuge20R型冷冻离心机，DU640型紫外分光光度计（美国Beckman公司）；LEICAEG1150ST5020型自动包埋机，LEICARM2265型全自动轮转切片机（德国Leica公司）；MultiskanGO型全波长酶标仪（美国ThermoFisherScientific公司）；SW-CJ-ZF型超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）；272007028型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR）仪（美国Appliedbiosystems公司）；日立H-7650型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。

2、方法

2.1开心散的制备

参照文献制备方法[20,22]，开心散由人参片、茯苓、石菖蒲、远志组成，按照3∶3∶2∶2比例投料，石菖蒲加6倍药材量的水加热回流提取8h，收取挥发油后药渣备用；人参以60%乙醇加热回流提取2次，合并提取液过滤备用，人参药渣备用；石菖蒲和人参片药渣与茯苓、远志合药共煎1h，合煎滤液与人参提取液合并，旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩至含生药量为1g·mL-1溶液，最后将石菖蒲挥发油加入混匀，置于4℃冰箱保存备用。

2.2分组和给药

将72只小鼠随机分为6组，每组12只：正常组，模型组，多奈哌齐组和开心散低、中、高剂量组。正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，开心散低、中、高剂量组分别灌胃0.7,1.4,2.8g·kg-1·d-1，多奈哌齐组灌胃2mg·kg-1·d-1[23]，连续给药2个月（60d）。

2.3Morris水迷宫实验

给药结束后进行Morris水迷宫实验，参照文献的实施方法及步骤[24]。实验内容包括适应性训练、定位航行和空间探索，共进行7d。第1天为适应性训练，练习小鼠站台。第2～6天进行定位航行，以小鼠入水后找到逃生平台所花费的实际时间（即逃避潜伏期）为观察指标，若60s内未找到平台则记录为60s。第7天撤去站台，记录60s内小鼠在原站台所在象限（即第四象限）停留的具体时间、穿越原站台位置的次数及平均游泳速度。

2.4透射电镜观察APP/PS1小鼠海马神经元超微结构

将小鼠脑切片用0.1mol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，1%锇酸固定（2h,4℃），用上述缓冲液洗3次，梯度乙醇和丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋，聚合，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，60V透射电镜下观察拍照并记录。

2.5比色法检测血清ACh,AChE,ChAT含量

将血清以4℃，12000r·min-1离心10min（离心半径12cm，下同），取上清，采用比色法检测血清中ACh,AChE,ChAT的含量，检测步骤参照试剂盒说明书。

2.6比色法检测小鼠海马ROS,MDA,SOD,GSH-Px含量

将小鼠海马称质量后于冰上匀浆，4℃，12000r·min-1离心10min，取上清，采用比色法检测海马中ROS,MDA,SOD,GSH-Px的含量，检测步骤参照试剂盒说明书。

2.7Real-timePCR检测小鼠海马BDNF，β-神经生长因子（NGFB),discs大同源物（DLG)2,DLG4,SYPmRNA表达

将海马组织加入TRIzol1mL，冰上充分研磨匀浆，离心取上清液，加入三氯甲烷充分混匀后静置，将上清液转移至新的离心管内，加入异丙醇混匀后沉淀，离心10min后管底的白色沉淀即为RNA，抽吸去除液体，加入75%乙醇洗涤，离心后将液体抽吸干净，置于超净台上吹3min，加入无酶水15μL溶解RNA,55℃孵育5min，用逆转录试剂盒将总mRNA逆转录为cDNA，使用SYBRGreenPCRMasterMix进行PCR扩增，稀释探针及相应引物，依次加入每管中，用Real-timePCR仪95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火30s,72℃延伸10s，反应共进行40个循环，记录结果。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，BDNF,NGFB,DLG2,DLG4,SYP引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

2.8统计学分析

实验数据采用SPSS20.0软件进行统计分析，数据结果以表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1对APP/PS1小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间及游泳速度的影响

与正常组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数显著减少，目标象限停留时间显著缩短（P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组和开心散中、高剂量组可明显缩短APP/PS1小鼠的逃避潜伏期、增加穿越平台次数、延长目标象限停留时间（P<0.05,P<0.01），开心散低剂量组可明显延长目标象限停留时间（P<0.05），各组间的游泳速度比较，差异无统计学差异。见表2。

3.2对APP/PS1小鼠海马神经元超微结构的影响

透射电镜下可见，与正常组比较，模型组线粒体数量明显减少，形态各异，排列不规则，部分线粒体明显肿胀、变形，线粒体嵴断裂，胞浆溶解、呈空泡状，细胞碎片较多。与模型组比较，多奈哌齐组及开心散低、中、高剂量组可减轻线粒体损伤，形态较规则，多呈椭圆形，线粒体肿胀、变形减少，线粒体嵴清晰。见图1。

3.3对APP/PS1小鼠血清ACh,AChE,ChAT水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清ACh,ChAT水平明显降低，AChE水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组和开心散中、高剂量组明显升高ACh,ChAT水平（P<0.05,P<0.01），明显降低AChE的活性（P<0.05）。见表3。

3.4对APP/PS1小鼠海马ROS,MDA,SOD,GSH-Px的影响

与正常组比较，模型组小鼠海马ROS,MDA明显升高（P<0.05,P<0.01),SOD,GSH-Px显著下降（P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组和开心散高剂量组明显降低ROS,MDA水平（P<0.05,P<0.01），明显提高SOD,GSH-Px的活性（P<0.05,P<0.01）。见表4。

3.5对APP/PS1小鼠海马BDNF,NGFB,DLG2,DLG4,SYPmRNA表达的影响

与正常组比较，模型组BDNF,NGFB,DLG2,DLG4,SYPmRNA水平明显下降（P<0.05,P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组，开心散中、高剂量组各mRNA表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01），开心散低剂量组SYPmRNA水平明显升高（P<0.05）。见表5。

4、讨论

突触是学习记忆形成与维持的重要形态学基础，是神经元之间相互联系并借以传递信息的关键结构[23]。突触的超微结构与学习记忆及认知功能关系密切[24]，突触数量减少、突触信息传递功能减慢、突触可塑性相关蛋白表达减少是AD发病的重要因素[25]。突触可塑性是突触效能长期变化形成记忆的过程，Aβ沉积可抑制突触可塑性，减少树突棘和突触密度，引起线粒体功能障碍、神经元损伤及突触丢失[26]。突触可塑性相关蛋白参与调控突触的生长、发育、成熟等过程，其表达异常会引起认知功能受损[27]。

SYP为轴突末梢的突触前囊泡膜上所特有，参与突触形成、突触囊泡再循环、维持突触功能的一种钙结合酸性糖蛋白[28]，脑内SYP不足或缺乏时会导致学习记忆障碍[29]。PSD-95为突触后膜上的骨架蛋白，由DLG4基因编码产生，参与树突棘形成、突触连接及信号转导，并维持突触可塑性[30]。Aβ可诱导PSD-95蛋白表达水平下调，进而影响突触可塑性[31]。突触后致密物93(PSD-93）由DLG2基因编码产生，在皮层和海马表达丰富，DLG2基因突变可影响胆碱受体功能，是AD及帕金森病的易感基因[32]。神经生长因子（NGF）是一种高效多能的神经细胞生长调节因子，包括α，β，γ三种亚基，其中仅有β亚基具有生物学活性，参与神经元的生长发育、增殖、再生的调控过程[33]。BDNF是中枢神经系统分布最广泛的神经调节因子，参与了神经元存活、分化及生长发育。相关研究证实，PSD-93,BDNF,NGF,SYP等蛋白表达水平低下，是认知障碍的重要原因[35,36,37]。本研究运用APP/PS1双转基因小鼠作为AD动物模型，随着月龄的增长，脑内Aβ沉积日渐增多，其诱导的神经元变性、突触丢失、突触可塑性相关蛋白水平下降等，能够较好的模拟AD的发病机制[34]。本研究结果发现，与正常组比较，模型组线粒体数量明显减少，形态各异，排列不规整，部分线粒体明显肿胀、变形，线粒体嵴断裂，细胞碎片较多，突触可塑性相关蛋白BDNF,NGFB,DLG2,DLG4,SYPmRNA表达明显下降。

AD患者脑内沉积的Aβ和高度磷酸化的微管相关蛋白（tau）可诱导氧自由基生成增加、脂质过氧化，产生氧化应激损伤[38,39]。在神经老化、基因突变和外界环境等多重因素下，脑内氧化应激损伤明显，ROS,MDA产生过多，SOD,GSH-Px抗氧化能力下降，加速AD患者脑内病理产物的形成[40]。本项研究发现，与正常组比较，模型组小鼠海马内ROS,MDA水平明显增高，SOD,GSH-Px活性明显下降，表明脑内氧化应激损伤显著。ACh是学习记忆的重要神经递质，AChE和ChAT对ACh的含量起调节作用[41]。AD患者基底前脑胆碱能神经元数目减少，ACh含量下降，是学习记忆力减退、认知功能障碍的重要发病机制[42]。本研究中发现，模型组小鼠血清ACh,ChAT显著下降，AChE活性显著升高。因此，通过抑制AChE活性，提高突触间隙ACh的含量，是改善AD模型空间学习记忆和认知功能的有效策略[43]。

祖国医学认为，脾肾阳虚无力运化湿浊，痰浊闭阻心窍则呆傻愚笨，脾肾虚衰、痰浊阻窍为AD病机的关键[44]。开心散是临床常用的益智健脑基础方，方中人参大补元气，安神益智；茯苓健脾宁心，利水渗湿；石菖蒲化痰醒神开窍；远志宁心安神，祛痰开窍。针对AD本虚标实的病机特点，开心散健脾益气固其本，化痰开窍祛其标，补中有泻，寓泻于补。既往研究发现，开心散所含的活性成分人参皂苷类，多糖类，皂苷类，α-细辛醚和β-细辛醚等具有神经保护、抗痴呆作用[45]，与课题组前期的研究结果基本一致[20,21]。本项研究结果证实，给予开心散后各组线粒体损伤减轻，形态较规则，线粒体肿胀、变形较模型组减少，突触可塑性相关指标BDNF,NGFB,DLG2,DLG4,SYPmRNA表达水平增加，提示开心散具有神经突触保护作用。另外开心散各组SOD,GSH-Px,ACh,ChAT提高，ROS,MDA,AChE水平降低，空间学习记忆能力改善，提示开心散改善APP/PS1小鼠学习记忆能力，可能与抗氧化应激，调节胆碱能神经递质有关。开心散低剂量组与模型组比较，虽部分检测指标无统计学差异，但整体呈现逐步改善趋势。开心散可能是治疗AD的潜在药物，但由于复方成分复杂，仍需进一步明确其抗AD的物质基础；另外开心散如何发挥抗AD的确切机制，仍需进一步明确作用靶点。

文章来源：许玉珉,沈晓明,兰瑞,朱世瑞,张杰,路芳梅,王保奇,马云枝.开心散对APP/PS1小鼠学习记忆能力和突触功能的机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):15-22