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生长调节癌基因-α经AKT/mTOR通路调控老年瘢痕成纤维细胞增殖

2024-12-12 96 上传者：管理员

摘要：目的研究生长调节癌基因(GRO)-α对老年瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法 3例瘢痕组织来源的成纤维细胞分别分为1、2、3组，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组分泌型GR0-α含量，并利用细胞增殖(CCK)-8实验研究GRO-α通过内源性途径对1、2、3组细胞增殖的影响；因2组细胞CRO-α含量最低，故后续选取2组细胞分别加入0、2、5、10 ng/ml GRO-α处理，记为0、2、5、10 ng/ml组，利用CCK-8实验研究不同浓度GRO-α通过外源性途径对细胞增殖的影响，并利用Westemn印迹检测不同浓度GRO-α对细胞蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达的影响。结果老年瘢痕成纤维细胞可表达GRO-α,且1组和3组在48和72 h增殖能力显著高于2组(P<0.05);与0 ng/ml组比较，10 ng/ml组细胞在24 h增殖能力显著增强(P<0.05),2、5和10 ng/ml组细胞在48和72 h增殖能力显著增强(P<0.05);培养72 h,与0 ng/ml组比较，2、5和10 ng/ml组细胞AKT和mTOR蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论 GRO-α可通过促进老年瘢痕成纤维细胞增殖而参与瘢痕疙瘩形成，其机制与活化AKT/mTOR信号通路有关。

关键词：
增殖
生长调节癌基因-α
瘢痕成纤维细胞
蛋白激酶B
雷帕霉素靶蛋白
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瘢痕疙瘩以成纤维细胞过度增生、胶原蛋白和纤连蛋白过量沉积为特征，是创伤愈合最常见的病理形式[1,2]。瘢痕疙瘩具有肿瘤及炎症特性，它可向外扩展增长并超出原有创缘，在皮肤表面形成鲜红色或淡紫色的结痂和斑块，这不仅影响了美观，还严重降低了患者的生活质量[1,2]。目前，瘢痕疙瘩发病率呈现逐年上升趋势，且复发率几乎可达100%,加之临床尚无有效治疗方案，因此，更好地了解与瘢痕疙瘩形成有关的潜在调节机制对于其治疗和预后具有重要意义[1,2]。由于老年人瘢痕愈合速度较慢且发生并发症的风险相对较高，因此预防老年人瘢痕形成显得尤为重要[3]。

趋化因子是一类小分子分泌性细胞因子家族，他们可通过特异性结合其受体而在炎症和免疫应答中发挥重要调节作用。根据N端半胱氨酸分子的数量和位置，趋化因子可分为CC、CXC、CX3C和C四个亚家族[4]。趋化因子受体包括经典的趋化因子受体和非典型的趋化因子受体(ACKRs)。经典的趋化因子受体属于G蛋白耦联七次跨膜受体(GPCRs),当其与配体特异性结合后可调节细胞迁移(趋化)、黏附、定位和细胞-细胞间相互作用等功能；而非典型趋化因子受体则不具有诱导细胞迁移(趋化)活性[5]。趋化因子系统由近50个趋化因子配体、20个GPCRs和4个ACKRs组成，它们在发育、稳态、炎症、感染和肿瘤发生等生理和病理过程中发挥重要作用[5]。研究证实，在伤口愈合过程中，趋化因子可严格调控白细胞招募，且有助于调节上皮形成、组织重塑和血管生成，这些证据说明趋化因子是人类皮肤伤口愈合的重要调节剂[6]。此外，研究也证实，由趋化因子介导的炎症反应在瘢痕疙瘩病变的发展中亦发挥重要的作用[7]。生长调节癌基因(GRO)-α又称CXC趋化因子(CXCL)1,本课题研究GRO-α对老年瘢痕成纤维细胞增殖的影响，并探索GRO-α发挥作用的可能信号通路。

1、材料与方法

1.1实验用主要试剂耗材

DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司；GRO-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德公司；细胞计数试剂盒(CCK)-8购自上海翌圣生物公司；电化学发光(ECL)试剂购自Thermo Fisher公司；兔抗蛋白激酶B(AKT)单克隆抗体和兔抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)单克隆抗体购自上海Abways公司；鼠抗β-actin单克隆抗体购自ImmunoWay公司。

1.2人瘢痕成纤维细胞的分离与培养

将佳木斯大学附属第一医院整形美容烧伤创面中心手术切除的3例老年患者的瘢痕组织剪去表皮及皮下组织，并修剪成边长约0.5 mm的组织块；用培养基洗涤后平铺于培养瓶底，并加入5 ml含10% FBS和青链霉素的培养基培养；每隔3 d更换新鲜培养基，待成纤维细胞融合度达到80%后进行传代培养。将3例瘢痕组织来源的成纤维细胞分别分为1、2、3组，检测各组GRO-α含量。因2组GRO-α含量最低，故后续选取2组细胞，分别加入0、2、5、10 ng/ml GRO-α处理，记为0、2、5、10 ng/ml组，测定24、48、72 h细胞增殖情况。

1.3 ELISA检测GRO-α水平

将成纤维细胞按1.0×106个/孔接种到6孔板各孔中，细胞所用为1 ml无FBS的培养基；培养24 h后，吸取上清液，利用试剂盒检测培养基中GRO-α水平。

1.4 CCK-8细胞增殖实验

将成纤维细胞按1.5×103个/孔接种到96孔板各孔中，细胞所用为100μl含10%FBS的培养基；在细胞培养至24、48和72 h,分别向各孔中加入10μl CCK-8试剂，并将孔板在培养箱中孵育1 h;用全自动酶标仪测得各孔450 nm波长处的吸光度(OD)值。

1.5 Western印迹实验

0、2、5、10 ng/ml组处理72 h时测定AKT、mTOR蛋白表达。将30μg总蛋白进行恒压电泳并将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上；将膜常规封闭后分别置于兔抗AKT抗体(稀释比为1∶1 000)、兔抗mTOR抗体(稀释比为1∶1 000)或鼠抗β-actin抗体(稀释比为1∶5 000)中4℃孵育过夜；将膜用辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(稀释比为1∶10 000)在37℃孵育1 h;滴加ECL试剂并于凝胶成像系统中曝光、拍照。

1.6统计学分析

采用SPSS22.0软件进行方差分析和q检验。

2、结果

2.1老年瘢痕成纤维细胞GRO-α表达

原代培养的1、2和3组老年瘢痕成纤维细胞培养基中GRO-α水平分别为(24.66±3.16)、(17.33±2.63)和(21.02±2.46)pg/ml,这表明上述细胞均表达并分泌GRO-α。3组细胞组间具有显著性差异，表现为1组水平最高、2组水平最低(F=12.30,P=0.000 4)。

2.2过表达GRO-α促进老年瘢痕成纤维细胞的增殖

从表1可见，在细胞培养48和72 h后，1组(高表达)和3组(中表达)细胞的增殖能力显著高于2组(低表达)(P<0.05);细胞培养72 h后，1组细胞的增殖能力显著高于3组(P<0.05)。说明内源性高表达GRO-α可促进老年瘢痕成纤维细胞增殖。

表1过表达GRO-α可促进瘢痕成纤维细胞的增殖

2.3外源性GRO-α重组蛋白促进老年瘢痕成纤维细胞的增殖

由表2可见，细胞培养24 h, 10 ng/ml组细胞增殖能力显著高于0 ng/ml组(P<0.05);细胞培养48和72 h, 2、5、10 ng/ml组细胞增殖能力显著高于0 ng/ml组(P<0.05)。细胞处理72 h, 10 ng/ml组GRO-α含量显著高于2 ng/ml组(P<0.05)。

2.4外源性GRO-α重组蛋白上调老年瘢痕成纤维细胞ERK和mTOR蛋白表达

与0 ng/ml组比较，2、5和10 ng/ml组AKT和mTOR蛋白表达水平显著增加(P<0.001)。见表2。

表2 GRO-α对瘢痕成纤维细胞增殖及ERK、mTOR蛋白表达影响

3、讨论

瘢痕疙瘩病变的特征是成纤维细胞过度增殖，并伴有白细胞浸润和胶原合成增多[8]。尽管老年人瘢痕的发生率较低，但由于他们常伴有多种慢性疾病和免疫功能下降，因此老年人在瘢痕愈合过程中面临着更高的如感染、溃疡等并发症的发生。此外，由于老年人的皮肤修复能力、血液循环和新陈代谢都较慢，因此当皮肤受损形成瘢痕时，其愈合速度也会放缓[3]。由于趋化因子具有化学吸引的功能，人们已经逐渐重视到其在病理性瘢痕形成中作用。研究表明，与正常的人类成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩形成的成纤维细胞表达的CXCL8水平有所增加[9]。此外，在瘢痕疙瘩形成患者中表达CXC趋化因子受体(CXCR)4的成纤维细胞绝对数量显著增加，且瘢痕疙瘩形成患者全身CXC12的水平也明显增高，这说明瘢痕疙瘩持续表达的CXLC12既是成纤维细胞的主要化学引诱物，又是局部炎症的下游介质[10]。真皮成纤维细胞可组成性表达CXCL12,且深层真皮成纤维细胞比浅表成纤维细胞更多表达CXCL12,烧伤后增生性瘢痕组织中CXCL12表达增加，而当皮下给予干扰素(IFN)-α2b来下调烧伤后增生性瘢痕组织中CXCL12表达后，可显著改善患者的瘢痕形成[11]。在人和动物模型中，许多研究强调了CC趋化因子(CCL)2/CC趋化因子受体(CCR)2轴在纤维化、硬皮病、肺纤维化、肾纤维化和结肠纤维化中的致病作用[12,13]。Ferreira等[14]通过向CCL2基因敲除小鼠背部皮下注射博来霉素来诱导小鼠真皮纤维化模型时发现，该小鼠中诱导的皮肤纤维化减少，表明CCL2是体内诱导皮肤纤维化发展的关键决定因素。

在有关GRO-α的研究中发现，与肥厚性瘢痕和正常皮肤组织比较，GRO-α及其受体CXCR2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达更为丰富，且其表达与炎症浸润程度呈正相关[8]。本研究对老年瘢痕疙瘩成纤维细胞的研究发现，细胞可构成性表达GRO-α;内源性高表达GRO-α或外源性给予GRO-α均可促进老年瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，且外源性给予GRO-α还可上调细胞AKT和mTOR蛋白表达水平。AKT是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路的重要分子，该信号通路在正常细胞的生理和肿瘤细胞的增殖、迁移和肿瘤发生中具重要作用[15]。研究也证实PI3K/AKT信号通路参与了瘢痕疙瘩的形成。如Wang等[16]发现，PI3K/AKT通路可通过调节糖酵解促进缺氧条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，并抑制其凋亡。此外，利用miR-188-5p阻断PI3K/AKT信号通路则可抑制瘢痕疙瘩增殖和侵袭[17]。mTOR是PI3K/AKT通络的重要下游分子，PI3K/AKT/mTOR通路对伤口的愈合过程也可产生影响，如可调控细胞迁移、增殖、细胞外基质成熟及瘢痕疙瘩的发育[18,19]。此外，该通路还可影响瘢痕疙瘩的疗效。如舒尼替尼可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路有效抑制瘢痕疙瘩的发展，因此有可能成为治疗瘢痕疙瘩的有效疗法[20]。

参考文献:

1乔少然.CXCR1/CXCR2拮抗剂-G31P对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及基质金属蛋白酶-2表达的影响[D].大连:大连医科大学,2016.

基金资助:佳木斯大学国家基金培育项目(JMSUGPZR2022-008);

文章来源:朱美缔,孙越,张浩,等.生长调节癌基因-α经AKT/mTOR通路调控老年瘢痕成纤维细胞增殖[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5850-5853.