首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 基础医学论文 > 人体解剖学论文 > 观察研究多疣壁虎脑和脊髓解剖结构的三维重建和体视学测量

观察研究多疣壁虎脑和脊髓解剖结构的三维重建和体视学测量

2020-07-13 264 上传者：管理员

摘要：目的：建立多疣壁虎中枢神经系统结构的三维立体模型，获取中枢神经系统相关结构的定量数据。方法：多疣壁虎头颈部连续冠状切片行Nissl染色和Luxolfastblue(LFB）染色，通过显微镜分区拍摄获得切片的二维图像。利用Photoshop7.0对图像拼接、旋转、配准后，采用3D-Doctor软件进行三维重建。运用体视学方法对壁虎头部进行定量研究。结果：三维重建的头颅、脑和视神经的立体图像逼真自然，能清楚地区分端脑、间脑、中脑、延髓以及小脑，同时能弄清壁虎脑在颅内位置及相互关系。壁虎颅腔的容积为（25.83±1.46)mm3，全脑体积为（19.99±2.15)mm3、端脑体积为（7.53±0.33)mm3、单侧大脑皮层体积为（0.19±0.02)mm3、小脑体积为（0.22±0.02)mm3、海马体积为（0.16±0.02)mm3，脊髓颈膨大、灰质和白质面积分别为（0.70±0.02)mm2、（0.28±0.01)mm2、（0.36±0.01)mm2，颈膨大灰质与白质面积比是0.78，腰骶膨大、灰质和白质的面积分别为（0.75±0.01)mm2、（0.36±0.01)mm2、（0.38±0.01)mm2，腰骶膨大灰质与白质面积比是0.95。结论：获得多疣壁虎颅脑解剖结构的三维立体模型及相关脑结构的定量分析数据，为壁虎脑内实验和立体定向研究提供了三维解剖学依据。

关键词：
三维重建
体视学
多疣壁虎
脊髓
解破学
加入收藏

依靠计算机辅助的三维重建可视化技术，逐渐广泛地应用于医学领域[1,2]。将体视学方法与三维重建可视化技术相结合，更好地对神经科学研究的重要内容之一就是多种神经结构进行形态学研究[3]。将SD大鼠脑干冰冻切片后进行焦油紫染色，利用软件重建出大鼠海马结构，并且可以计算重建海马各区的体积[4]。通过运用无偏体视学方法和电子显微镜技术定量研究了年龄变化对大鼠皮质、胼胝体中有髓鞘纤维的皮质体积、总体积、总长度和平均直径的影响[5,6]。师晓燕等[7]采用光学分合法建立了定量研究海马结构内神经元和突触数目的研究方法。壁虎（Gecko）隶属爬行纲、晰蝎目、晰蝎亚目、壁虎下目、壁虎科、壁虎属。常见的有多疣壁虎、无蹼壁虎、蹼趾壁虎与大壁虎。大壁虎的定位脑图谱已经构建完成及其三维重建有了初步研究[8]。而多疣壁虎作为再生能力很强的脊椎动物，成为神经生物学研究的模型动物[9,10]。沈宓等[11]将壁虎脊髓切片行尼氏染色，重建了壁虎脊髓颈膨大至颈3节段。目前壁虎头颈部的整体重建未见报道，本研究分别基于尼氏（Nissl's）染色和固蓝染色法对壁虎头颈部和躯干作整体三维立体结构重建，并运用体视学方法对壁虎颅骨容积、全脑、端脑、大脑皮层、小脑、海马体积和脊髓颈膨大、腰骶膨大及其灰质和白质的平均面积进行定量测量，以期为壁虎脑和脊髓内实验和立体定向研究提供三维解剖学数据。

1、材料和方法

1.1实验动物

正常成年多疣壁虎20只，雌雄不限（由南通大学动物实验中心提供），体质量（4.92±0.58)g，头体长（吻端至泄殖腔的距离）为（6.57±0.10)cm。饲养在22℃～25℃、饱和湿度的空调房，自由取食黄粉虫和水。

1.2Nissl染色和LFB染色

将壁虎放冰袋上冰冻麻醉，然后取头部和颈部，4%的甲醛溶液进行固定，2d后对标本进行梯度脱水，标本沉底后进行连续冰冻切片，片厚40μm。

将壁虎头颈部切片进行常规Nissl染色，切片依次在下列制剂中浸没5min：二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，100%乙醇Ⅰ，100%乙醇Ⅱ，95%乙醇，70%乙醇，在蒸馏水中浸泡后置入1%焦油紫15～30min，清水漂洗。常规脱水透明，中性树脂封片。

将壁虎头躯干切片LFB染色，先将切片放入无水乙醇：氯仿1∶1混合溶液中8h，然后转入95%乙醇5min，在0.1%LFB液56℃过夜，再将标本移入95%乙醇溶液5min，转入70%乙醇3min，此时标本呈墨绿色，灰质、白质尚不能分清。蒸馏水清洗标本3min，置于0.05%碳酸锂溶液中分化5min,70%乙醇溶液分化30s，蒸馏水洗片。镜下观察脑核团、白质边界和脊髓灰质与白质边界清晰后将标本放入双蒸水洗片。常规脱水透明，中性树脂封片。

1.3图像摄取和二维处理

将标本依次置于Leica光学显微镜照相系统进行拍摄，拍摄物镜为2.5倍，目镜为10倍。拍摄完图像后利用Photoshop7.0对切片进行拼接，将4个不同区的视野拼接成1张图片，如图1所示。另选1只壁虎作1个正中纵切面，作为图像配准的参照，如图2。躯干部位的配准则以脊髓中央管中点为坐标点，如图3所示。

1.4三维重建

利用Photoshop7.0对所有图片调整和定位好后，打开3D-Doctor4.0，导入图片，定义需要重建的结构并设定其描记的颜色。如图4所示。对所有图片进行分割处理后，点击“3DRendering→SurfaceRendering→SimpleSurface”进行表面三维重建，并对重建后的结果进行观察、切割和测量。

1.5体视学测量

用体视学方法测量计算器官或组织体积的实现过程如图5A所示，先将所要测量的组织等距随机切成若干片，间距为T，则第4片组织片的体积≈组织片的，因此整个组织的体积为V=ΣAi*T。计算面积A则用点计数法实现，如图5B所示。点计数法就是把事先制作的关联测格叠加于切片图像上，然后记录落在切片图像上的测点数。在关联测格中，若d为一方格的边长时，被观察物图像内的测点数为p，则观察物测面的面积为：A=d2，如图6所示。

2、结果

2.1三维重建

三维重建模型能够自由旋转、缩放，并从任意角度观测颅骨与头部、脑与颅骨，以及视神经与脑的结构关系，较好地反映众多复杂结构的外形和立体结构（图7）。通过重建模型可以看出壁虎的大脑表面光滑不存在沟回结构，而且壁虎小脑比较小，从重建模型中可以看到小脑在延髓上部体积较小。从重建模型中可以看出壁虎从颈到泄殖腔间有29个椎骨，脊髓充满整个椎管，也明显出现颈膨大和腰骶膨大，而且腰骶膨大比颈膨大粗大。

2.2体视学测量

本实验运用体视学方法测量壁虎颅骨容积为（25.83±1.46)mm3，全脑体积为（19.99±2.15)mm3，端脑体积为（7.53±0.33)mm3，一侧大脑皮层体积为（0.19±0.02)mm3，小脑体积为（0.22±0.01)mm3，海马体积（0.16±0.02)mm3，脊髓颈膨大的平均面积、灰质面积和白质面积分别为（0.70±0.02)mm2、（0.28±0.01)mm2、（0.36±0.01)mm2，颈膨大灰质与白质面积比是0.78，腰骶膨大的平均面积为（0.75±0.01)mm2，灰质面积（0.36±0.01)mm2，白质面积为（0.38±0.01)mm2，腰骶膨大灰质与白质面积比是0.95。

图1显微镜分区拍摄后，拼接4个视野的图像。

图2壁虎头部的正中矢状切面。

图3X轴和Y轴的定位.

图4体表、颅骨、脑、视神经、脊髓、灰质和椎骨的分割。

图5组织等距切片和面积测量。

图6点计数测格测量切片面积。

图7壁虎头颈部的三维图像显示颅骨与头部、脑与颅骨和视神经与脑之间的位置结构关系。

3、讨论

神经系统或神经系统中某些结构的三维重建，为神经示踪实验提供直观、准确的空间解剖定位，进一步理解脑的特定部位的功能[12]。利用3D-Doctor软件对大鼠脑干连续冰冻切片进行三维重建，观察一氧化氮合酶阳性神经核团在脑干中的三维分布[13]。临床上将CT扫描所得的DICOM数据，运用3D-slicer建立脑内血肿及颅骨等结构关系的三维模型，设计虚拟手术路（测定穿刺角度及深度），可显著提高对血肿中心区穿刺置[14]。

本研究在三维重建过程中需要考虑到一个重要影响因素是连续图片之间的配准，配准即确定图像像素点在空间的位置，从而将二维图像合成三维图像，图片间配准是否准确，一致直接影响重建的效果。目前解决的方法主要是利用外配准和内配准的方法[15]，外配准法一般是在制作切片前，用各种方法在组织块上或附近作标记来进行定位，通常是利用细针、激光或微电极穿孔。内配准法是指根据生物组织的解剖学特点，在切片图像中寻找特定的定位结构来进行定位。在本实验用观察纵切面并结合内配准法对图像进行配准，取得较理想的结果。因此，本次实验结果基本能呈现活体脑组织原有结构和位置。由于本实验是对颅骨、脑、视神经、外耳道、躯体、椎骨、脊髓和灰质进行三维重建，这些结构在切片上边缘清晰连贯，所以在图像分割上并不用费力，只要耐心将需要重建的结构用不同颜色线条勾勒出来即可。

本研究用体视学的方法对壁虎的大脑皮层和海马体积进行测量，对于了解爬行动物行为、神经系统进化，尤其大脑的进化有着重要的意义[16]。本研究结果显示，壁虎脊髓腰骶膨大比颈膨大的平均横截面面积要大，另外腰骶膨大的灰、白质面积比是0.95，而颈膨大的灰、白质面积比是0.78，说明腰骶膨大的灰质与白质面积基本相等，而脊髓颈膨大中灰质面积比白质明显小。

本实验对多疣壁虎头颈部连续Nissl染色切片和头躯干整体连续LFB染色切片成功重建出壁虎的头颈部、颅骨、全脑、视神经、椎骨、脊髓的三维模型，同时反映出壁虎脑结构和颅骨的空间位置关系，为壁虎脑内实验和立体定向提供了三维解剖学依据。

参考文献：

[3]李杨,彭瑞云.中国生物医学体视学发展现状与展望[J].中国体视学与图像分析,2016,21(1):66-75.

[4]季达峰,孙李颖,宋佳敏,等.组织学切片法在三维重建大鼠海马结构中的应用价值[J].复旦学报医学版,2013,40(2):217-221.

[7]师晓燕,赵圆宇,卢伟,等.运用新的体视学方法定量研究大鼠海马结构神经元和突触数目[J].第三军医大学学报,2011,33(13):1328-1332.

[8]戴威.小动物电生理信号无线记录系统与遥控刺激系统研究[D].南京:南京航空航天大学,2017.

[11]沈宓,汤敏,丁斐.壁虎颈髓连续组织切片计算机三维重建研究[J].神经解剖学杂志,2011,27(3):335-339.

[13]季达峰,罗时鹏,韩笑,等.大鼠脑干连续冰冻切片在NOS阳性神经核团三维重建中的应用[J].神经解剖学杂志,2013,29(2):173-176.

张明敏,李耀富,季达峰,吴辉群,谢童瑶,韩梦娇,吕广明.多疣壁虎脑和脊髓解剖结构的三维重建及体视学测量[J].解剖学杂志,2020,43(01):51-55.

基金:南通大学研究生科技创新计划项目(YKC16068).