阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆力和认知功能障碍为主的中枢神经系统退行性疾病[1]。随着人口老龄化进程不断加快,AD患病率呈逐年上升趋势,不仅给个人生活带来极大困扰,也给家庭和社会带来沉重负担[2,3]。目前尚无治疗AD的特效药物,近年来多项关于靶向抑制β淀粉样蛋白(Aβ)生成、聚集的药物疗效及安全性研究结果欠佳,因此,明确AD的病理机制并寻找有效治疗靶点对AD的临床治疗具有重要意义[4,5,6]。

细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin dependent kinase 5,CDK5)在神经元的迁移分化、存活和突触的可塑性等方面发挥着重要作用[7]。前期研究[8,9]表明,电针能通过调控Tau蛋白磷酸化过程中糖原合成酶激酶-3β和蛋白磷酸酶2的活性,抑制Tau蛋白过度磷酸化,从而改善由神经原纤维缠结生成引起的突触可塑性损伤,提高AD模型鼠的学习记忆能力。本研究运用行为学、形态学及分子生物学等检测手段对SAMP8小鼠海马区CDK5、p25、Tau-5蛋白等进行观察,以期揭示针灸防治AD的具体机制,为临床治疗提供可靠依据。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

SPF级5月龄雄性SAMR1小鼠15只、SAMP8小鼠45只,体质量(13±3)g,由天津市实验动物研究中心提供,生产许可证号:SCXK(津)2015-0003。将45只SAMP8小鼠随机分为模型组、电针组和针刺组,每组15只,以同品系SAMR1小鼠为正常组。实验前所有小鼠均置于清洁、安静的环境中分笼饲养,室温(24±2)℃,相对湿度30%～70%,自由摄食饮水,适应性喂养1周。整个实验过程遵守国家科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2主要试剂与仪器

无水乙醇、二甲苯、石蜡、中性树脂(国药集团),凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),苏木精、CDK5、p25、Tau蛋白抗体(美国Sigma)。

Morris水迷宫及动态图谱分析系统(中国医学科学院药物研究所),透射电子显微镜(美国FEI公司),病理切片机(德国Leica),光学显微镜(日本奥林巴斯),华佗牌针灸针(苏州环球针灸医疗器械有限公司),HANS-100A电针仪(南京济生医疗科技有限公司),电泳仪、电转仪、电泳槽(美国Bio-Rad),Image Ouant LAS4000型凝胶成像系统(德国GE)。

1.3干预方法

针刺组针刺“百会”及双侧“肾俞”:参考《实验针灸学》[10]小鼠穴位图谱选取“百会”(顶骨正中)和“肾俞”(第2腰椎下旁开7 mm),将小鼠用医用胶布固定四肢及背胸部于操作台上,用0.16 mm×7 mm针灸针,“百会”向前平刺3～5 mm,“肾俞”向后正中线、与皮肤呈45°斜刺5 mm,留针20 min。电针组在针刺组基础上予双侧“肾俞”连接电针仪,连续波,频率2 Hz,电流1 mA,以小鼠肢体微颤为宜,持续20 min。每日1次, 7 d为1个疗程,疗程间休息1 d,共治疗4个 疗程。正常组和模型组仅予相同的抓取和固定。

1.4观察指标和检测方法

Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力:Morris水迷宫主体外形是一个表壁光滑的圆形水池(高度60 cm、直径120 cm、水深15 cm);均分为4个象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限),控制水温(25±2)℃,位于第Ⅳ象限小鼠逃生站立的圆形平台直径为8 cm,没于水下1 cm,水池上方安装有记录小鼠游泳轨迹的摄像头,实验过程中尽量保持外部条件不变。干预结束后,参照文献[11]经Morris水迷宫测试进行筛选,剔除溺水等应激反应较大、原地打圈或立刻游回等过于灵敏的小鼠,正式水迷宫定位航行实验连续5 d。实验第1天,将小鼠分别从池壁4个起始点面向池壁放入水池,记录60 s内找到平台的时间(即逃避潜伏期);若小鼠在60 s内找不到平台,将其引上平台停留10 s,其逃避潜伏期计为60 s。选取不同象限为入水点,每次间隔5 min,取4次测试的平均值。第6天将平台撤去,把小鼠自第Ⅲ象限池壁中点轻放入池中,待其自由游泳60 s后结束实验,系统将自动记录小鼠在水中游泳至原平台所在象限的停留时间与跨越原平台位置的次数及游泳轨迹,并对其进行统计分析。

透射电镜观察小鼠海马CA1区神经元形态变化:Morris水迷宫实验结束后禁食12 h,以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。每组取3只小鼠麻醉后暴露胸腔,用4%多聚甲醛行左心室灌注,断头后分离出海马组织,浸入装有2.5%戊二醛固定液的培养皿中,冰袋上迅速切下海马CA1区组织并分离成1 mm×1 mm×1 mm小块,1.5%多聚甲醛固定液中4℃保存。将组织用超薄切片机切片,切片厚度70 nm,将切片贴于带膜单孔230目铜网。铜网上滴入2%醋酸铀溶液染色20 min,双蒸水清洗,干燥后用柠檬酸铅溶液染色15 min,双蒸水洗净,干燥后放入抽拉式样品盒内,先用低倍镜全面定位海马CA1区的锥体细胞,再换高倍镜观察突触超微形态,使用透射电镜CCD相机图像采集分析系统进行拍片并分析,每张切片观察5个视野。

免疫组织化学法检测海马区CDK5阳性表达:每组取6只小鼠于麻醉后暴露胸腔,用4%多聚甲醛行左心室灌注,断头取脑分离海马CA1区组织,浸入4%多聚甲醛,4℃固定24～48 h。梯度乙醇脱水,60℃石蜡包埋,海马CA1区作冠状连续切片(厚4μm)。依次放入二甲苯Ⅰ(10 min)、二甲苯Ⅱ(10 min)、二甲苯Ⅲ(10 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)、95%乙醇(5 min)、90%乙醇(5 min)、80%乙醇(5 min)、70%乙醇(5 min)中进行脱蜡,山羊血清室温封闭30 min。加入CDK5抗体(浓度1∶1 000)、二抗,复染、封片,光学显微镜拍照。运用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行分析,计算CDK5的平均吸光度值。

Western blot法检测海马区Tau-5和p25、CDK5蛋白的表达水平:每组取6只小鼠麻醉后断头取脑,于冰袋上快速取出双侧海马CA1区置于冻存管中投入液氮,-80℃保存。每只取海马组织80 mg,于液氮中充分研磨,按照每100 mg组织中加入1 mL RIPA裂解液和100μL苯甲基磺酰氟(1 mol/L)进行超声匀浆裂解,4℃12 000 r/min离心15 min,取上清液5μL进行蛋白定量,将裂解后的蛋白样品按1∶4加入5×SDS蛋白上样缓冲液混匀,100℃沸水中加热5 min使蛋白充分变性,-20℃保存待测。电泳、转膜和显影:蛋白样品经10%的分离胶和5%浓缩胶凝胶电泳后,根据预染蛋白Marker位置切取目的条带和内参条带,再将蛋白于预冷的转膜液里转至PVDF膜(200 mA,70 min),PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭1～2 h,加入Tau-5蛋白抗体(浓度1∶1 000)、p25抗体(浓度1∶500)和CDK5抗体(浓度1∶1 000)孵育过夜,次日加入二抗室温孵育2 h,洗膜30 min后按1∶1配制ECL显影液滴加到膜上,凝胶成像系统中拍摄图片,Image J软件分析条带灰度值,以目的蛋白与β-actin灰度值的比值为相对表达量。

1.5统计学方法

采用SPSS23.0统计软件处理数据,计量资料采用均数±标准差(x−±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,符合正态分布且方差齐时采用LSD检验,方差不齐采用Dunnett’s T3检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组小鼠行为学比较

定位航行实验中,与正常组比较,模型组小鼠平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,电针组和针刺组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05,P<0.01);与电针组比较,针刺组平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。见图1。

空间探索实验中,与正常组比较,模型组小鼠原平台象限停留时间缩短、跨越原平台次数减少(P<0.01);与模型组比较,电针组小鼠原平台象限停留时间延长、跨越原平台次数增多(P<0.01),针刺组小鼠原平台象限停留时间延长(P<0.05);与电针组比较,针刺组小鼠原平台象限停留时间缩短(P<0.05)。见图2、图3。

2.2各组小鼠海马组织超微结构比较

正常组小鼠海马神经元突触形态完整,核和膜结构清晰,可见较多数量的细胞器,内质网、线粒体、溶酶体和高尔基体等形态均正常;模型组小鼠海马形态不规则且模糊不清,神经元体积缩小,线粒体数目减少,肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变;针刺组小鼠海马神经元形态较规则,细胞器数目有所减少,胞质水肿严重,胞核固缩,内质网、核糖体及线粒体未见明显异常;电针组基本同正常组。见图4。

图1各组小鼠定位航行实验中平均逃避潜伏期比较

图2各组小鼠空间探索实验中原平台象限停留时间比较

图3各组小鼠空间探索实验中跨越原平台次数比较

2.3各组小鼠海马区CDK5阳性表达比较

CDK5阳性表达呈褐色。与正常组比较,模型组小鼠海马区CDK5阳性表达升高(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠海马区CDK5阳性表达减少(P<0.01)。见图5。

2.4各组小鼠海马区Tau-5和p25、CDK5蛋白表达比较

与正常组比较,模型组海马区Tau-5和p25、CDK5蛋白表达均显著升高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,电针组和针刺组海马区Tau-5和p25、CDK5蛋白表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);与电针组比较,针刺组海马区p25、CDK5蛋白表达升高(P<0.05),Tau-5差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

图4各组小鼠海马CA1区神经元超微结构

图5各组小鼠海马区CDK5阳性表达比较

图6各组小鼠海马区Tau-5、p25、CDK5蛋白相对表达量比较

3、讨论

针灸作为中医学的重要治疗手段,具有早期性、功能性和双向良性调节等特点[12]12]。电针治疗AD具有坚实的理论基础和一定的临床优势[13,14]13-14]。AD病因病机可概括为髓海不足、肾精亏虚[15]15]。《素问·骨空论》记载“病变在脑,首取督脉”,《铜仁腧穴针灸图经》曰“惊悸健忘,针入(百会)二分”,结合古籍和前期研究[16]16],本实验选取“肾俞”“百会”为治疗穴位进行观察。

SAMP8小鼠是从普通遗传群AKR/J系小鼠中通过选择培育出的快速老化小鼠,表现为早期增龄性学习记忆缺陷,同时伴有大量β淀粉样前体蛋白、Aβ在脑内产生,磷酸化Tau蛋白表达量增加等,这些均与AD患者脑内的病理改变相一致,是研究AD的理想动物模型[17,18]17-18]。研究[19,20]19-20]显示,与同龄正常老化SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠老化度评分于5月龄时开始升高,其皮质、海马区、纹状体和小脑开始出现Tau蛋白过度磷酸化及CDK5、CDK5/p25表达上调等病理改变,Tau蛋白过度磷酸化程度呈增龄性加重趋势,故本实验选用5月龄SAMP8小鼠作为AD的研究模型。

CDK5通过调节蛋白的特异性丝/苏氨酸位点,在神经元迁移分化、存活和突触的发生、信息传递、可塑性等诸多方面发挥重要作用[21]21]。CDK5需要与其调节蛋白p35、p39等激活因子结合形成CDK5/p35和CDK5/p39复合物才具有活性[22]22]。当细胞内游离Ca2+增加时,活化的钙蛋白酶作用下使p35降解为稳定的p25,p25与CDK5结合形成CDK5/p25复合物能持续活化CDK5,导致Tau蛋白过度磷酸化、炎性反应、Aβ沉积等病理改变[19,23]19, 23]。研究[24]24]指出,过表达p25的同时伴有CDK5活性增强、Tau蛋白高度磷酸化、神经原纤维缠结生成和细胞骨架紊乱,这说明CDK5/p25途径可能是AD病理生理学的一个重要组成部分。研究[9]9]发现,电针能通过调控Tau蛋白磷酸化过程中糖原合成酶激酶-3β和蛋白磷酸酶2的活性,抑制Tau蛋白过度磷酸化,从而改善由神经原纤维缠结生成引起的突触可塑性损伤,提高AD模型鼠的学习记忆能力,与本研究结果基本一致。

相比于普通针刺,电针既有普通针刺的作用,又可以达到稳定刺激输出,在针刺强度和频率上更有保障[25]25]。定位航行实验中逃避潜伏期随着训练时间增加呈下降趋势,电针组和针刺组下降幅度比模型组大,到第6天时电针组最短,说明电针较普通针刺更能提高SAMP8小鼠的学习记忆能力,延缓SAMP8小鼠AD的发病进程。第6天SAMP8小鼠原平台象限停留时间和跨越平台次数较正常小鼠明显降低,而电针和普通针刺均有升高,电针组升高更为明显,电针组和针刺组都提高了SAMP8小鼠的学习能力。透射电镜观察小鼠海马区超微结构显示,在神经元形态完整性、核膜结构清晰度等方面电针组优于模型组,说明电针可以通过改善SAMP8小鼠海马CA1区神经元的形态结构减慢AD发病的进程。免疫组织化学染色和Western blot结果表明,模型组小鼠较正常组的Tau-5、CDK5、p25表达高,经过电针和针刺的干预,这些指标均有下降,总体效果电针组优于针刺组,说明电针有效延缓了AD模型小鼠的发病进程。

综上所述,电针“百会”“肾俞”可以通过降低CDK5的表达,抑制Tau蛋白,改善海马组织的形态结构,提高小鼠学习记忆能力,对AD的防治具有积极作用。

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基金:国家自然科学基金项目(No.81373741)