EV71病毒是引发婴幼儿手足口病的主要病毒株，具有较强的传染性，会感染中枢神经系统[1]。EV71病毒引起的疾病是全球性传染病，世界上大部分地区均有此病流行的报道，其发病速度快、致死率高[2]。目前临床上抗EV71病毒的药物主要为利巴韦林和阿昔洛韦等，其治疗效果有限，长期服用容易引起肝损伤[3]。天然产物具有化学结构多样、特异性高、副作用低的特点，使其在具有抗EV71病毒作用的功能性食品开发中具有较高的安全优势。因此，对天然产物中具有抗EV71病毒作用活性成分的开发和利用尤为重要。

食用菌是婴幼儿重要的营养来源，具有高蛋白、低脂肪、氨基酸丰富、维生素多等显著的健康特性[4,5]。灰树花(Grifola frondosa)分布广泛，是一种具有独特芳香味、营养丰富、口味鲜美的食用菌[6],具有较高的药食两用价值。灰树花含有多糖、多肽、多酚、甾醇、三萜、皂苷、生物碱、有机酸、维生素、矿物质等成分[7],具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫及降血糖等显著的生物活性而受到广大消费者青睐[8]。前期已有报道证实了灰树花对HIV病毒、流行性感冒病毒和Ⅰ型单纯疱疹病毒具有不同程度的抑制作用[9]。灰树花多糖作为重要的活性物质，其药理作用引起了广泛关注[10]。如Zhao et al[11]通过水提醇沉法从灰树花菌丝体中分离纯化出一种分子质量为40.5 ku的多糖，能有效抑制EV71病毒的复制。目前，从灰树花中提取多糖的方法主要采用水提醇沉法。灰树花水提物在醇沉多糖的过程中会产生大量的上清液副产物，上清液含有一定量的多糖和蛋白质等优质活性物质，而大部分生产者将上清液作为废液，造成优质活性物质的浪费。从天然产物中提取活性物质后，为了充分利用生产中产生的副产物，研究者对此进行了诸多研究。如：张玥等[12]从石斛水提上清液副产物中提取了具有抗氧化活性和抑制α-淀粉酶活性的生物碱、多酚、黄酮及多糖类物质；黄晓冬等[13]提取的海藻铁钉菜水提醇沉上清液具有较强的降血糖作用；张智敏等[14]提取的玉竹水提醇沉上清液对阴虚型甲亢具有治疗作用。将上清液进行循环利用，富集溶液中的活性物质，可大大减少资源的浪费[15];此外，高分子质量的多糖和蛋白溶解性差、黏度高、生物活性降低[16],而低分子质量的多糖和蛋白具有较高的活性[17]。目前，关于灰树花多糖副产物中低分子质量多糖和蛋白肽的研究和利用的报道还十分缺乏。据此，本研究采用体外细胞培养的方法对灰树花水溶物(water-soluble extracts of Grifola frondosa, GFWE)抗EV71病毒活性进行探讨，旨在为增加灰树花产业附加值及开发新的抑制EV71病毒的功能性食品提供依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌、细胞和病毒

灰树花子实体购自浙江建松土特产经营部，由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心鉴定；非洲绿猿猴肾细胞(Vero)由中国科学院上海细胞库提供；EV71病毒由南京大学医学院提供。

1.1.2 试剂

葡萄糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖等单糖标品产自美国Sigma公司；DMEM(高糖)培养基、血清、胰蛋白酶产自新加坡Thermo Fisher Scientific公司；细胞培养所用青霉素-链霉素、PBS缓冲液产自Biosharp生物技术公司；BCA蛋白定量试剂盒、CCK-8试剂盒产自碧云天生物技术公司；通用型总RNA提取试剂盒产自北京金百特生物技术有限公司；gDNA清除试剂盒、荧光定量PCR试剂盒产自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱产自苏州德瑞普烘箱制造有限公司；FD-3型真空冷冻干燥机产自北京博医康实验仪器有限公司；HH型数显三用水浴锅产自金坛市精达仪器制造厂；U300液相色谱仪、QE Plus质谱仪、MK3型酶标仪产自美国Thermo公司；Vanquish型液相色谱仪、QE-HF-X型质谱仪产自美国Thermo公司；LC-10A型高效液相色谱仪、RI-10A型示差检测器产自日本岛津公司；ICS5000+离子色谱仪产自美国赛默飞世尔科技公司；Bruker VERTEX红外光谱仪产自布鲁克科技有限公司；MCO-5M型三气培养箱产自日本PHCbi公司。

1.2 GFWE的制备

灰树花子实体经烘干、粉碎、过筛(10目)后备用。在灰树花粗粉中按1∶15(g∶mL)的固液比加入超纯水超声提取1 h(超声处理温度80 ℃、超声功率400 W、超声频率45 kHz),重复提取2次后合并提取液，减压浓缩后得到灰树花水提物。向灰树花水提物中加入3倍体积的95%乙醇在4 ℃下醇沉24 h, 醇沉结束后离心分离得到上清液和沉淀。重复操作两次后合并上清液进行减压浓缩，得到灰树花水提上清液。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇逐步萃取除去灰树花水提上清液中的脂溶性成分和色素等小分子质量杂质，通过多次富集收集的萃余物溶液经真空冷冻干燥后得到GFWE。

1.3 GFWE化学成分的测定

1.3.1 总糖和蛋白质含量的测定

参照文献[18]的方法，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质含量。

1.3.2 主要化学成分的测定

参照文献[19]的方法进行样品前处理，用于超高效液相色谱二级质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-mass/mass spectrometry, UPLC-MS/MS)检测。

色谱条件[20]:色谱柱为ACQUITY UPLC® HSS T3 1.8 μm(2.1 mm×150 mm);自动进样器温度80 ℃;流速0.25 mL·min-1;柱温40 ℃;进样量2 μL;流动相为负离子(A)5 mmol·L-1甲酸铵和(B)乙腈及正离子(C)0.1%甲酸和(D)0.1%甲酸乙腈。

质谱条件[21]:仪器使用电喷雾离子源(ESI);正离子喷雾电压3.50 kV;负离子喷雾电压2.50 kV;毛细管温度325 ℃。

物质鉴定[22]:根据MS/MS碎片模式对Human Metabolome Database (HMDB)、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound以及苏州帕诺米克生物医药科技有限公司自建标准品数据库进行确认注释。

1.3.3 多糖组成的测定

使用离子色谱仪测定多糖组成。以岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、氨基半乳糖盐酸盐(GalN)、盐酸氨基葡萄糖(GlcN)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)、古罗糖醛酸(GulA)、甘露糖醛酸(ManA)等16种单糖为标准品，精密配制标准品混合液。根据绝对定量法测定单糖质量，根据单糖摩尔质量计算物质的量比。

色谱柱：Dionex CarbopacTM PA20 (3 mm×150 mm) ;流动相A为H2O;流动相B为15 mmol·L-1 NaOH与100 mmol·L-1 NaOAC的混合液；流速0.3 mL·min-1;进样量5 μL;柱温30 ℃;检测器为电化学检测器。

1.3.4 分子质量的测定

采用高效液相凝胶渗透色谱(HPGPC)法测定多糖的分子质量和纯度。

色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8 mm×300 mm);流动相为0.05 mol·L-1 NaCl; 流速0.6 mL·min-1;柱温40 ℃;进样量20 μL;检测器为示差检测器。

1.4 GFWE对Vero细胞增殖能力影响的测定

1.4.1 Vero细胞的培养与传代

取出冻存在液氮罐中的Vero细胞，置于37 ℃恒温水浴锅中迅速解冻。离心得到细胞沉淀，加入10%(体积分数)DMEM[含10%(体积分数)血清、1%(体积分数)青霉素-链霉素溶液、89%(体积分数)DMEM培养基]后置于培养箱(37 ℃、5% CO2)中静置培养，观察细胞的生长状态。

待细胞贴壁长满90%的培养瓶底层面时进行细胞传代。弃去培养瓶中的培养基，加入0.25%(体积分数)胰蛋白酶液，放置在培养箱中消化3 min后，迅速加入10%(体积分数)DMEM终止消化。轻轻混匀后离心，去除上清液，加入10%(体积分数)DMEM重悬细胞后转移到新的培养瓶中静置培养。

1.4.2 GFWE对Vero细胞存活率影响的测定

使用2%(体积分数)DMEM将GFWE按25～3 200 μg·mL-1的质量浓度配制，取100 μL添加到单层Vero细胞中，每组6个复孔，放置在培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养48 h。设置正常细胞作为对照组。采用CCK-8法测定波长450 nm处的光密度(D),计算细胞活力，确定安全上样量。

细胞活力

式中，孔中未加入样品的组别为对照组，孔中未接种细胞的组别为空白组。

1.5 GFWE对感染EV71病毒的Vero细胞影响的测定

1.5.1 EV71病毒的扩增与滴度测定

取出冻存于-80 ℃的病毒液，迅速解冻备用。将细胞培养基更换成含有EV71病毒的2%(体积分数)DMEM[含2%(体积分数)血清、1%(体积分数)青霉素-链霉素溶液、97%(体积分数)DMEM培养基]在培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养24 h。轻轻吹打培养瓶底面，将培养基转移到离心管中，反复冻融3次后离心，取上清液用0.22 μm滤膜过滤掉无用的细胞碎片，得到EV71病毒原液。

将Vero细胞接种至96孔板中，每孔细胞数量为1×104个·mL-1,培养24 h后将上清液替换成EV71病毒液[EV71病毒原液用2%(体积分数)DMEM从10-1至10-8共计8种含量进行稀释],同时以在正常细胞中加入2%(体积分数)DMEM作为对照组。将96孔板置于培养箱中培养，每天观察孔板中细胞形态的变化，待细胞的形态不再发生变化时开始计算半数组织细胞感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)。根据Reed-Muench法[23]可得出各含量病毒的TCID50。

1.5.2 Vero细胞形态变化的显微观察

为了探究GFWE对感染了EV71病毒的Vero细胞形态的影响，设置Vero细胞为正常组，感染EV71病毒的Vero细胞为模型组，Vero细胞经EV71病毒感染后分别加入利巴韦林和25～400 μg·mL-1GFWE为给药组。将样品置于培养箱中培养24 h后，在倒置显微镜下观察各孔细胞形态的变化。

1.6 GFWE对EV71病毒抑制率的测定

向单层Vero细胞中添加病毒量为感染复数(multiplicity of infection, MOI)=1的EV71病毒液，侵染2 h后，将上清液依次替换成25～400 μg·mL-1的样品液，并设置正常组、模型组、阳性对照组。将样品置于培养箱中培养24 h后，采用CCK-8法测定波长450 nm处的D,计算病毒抑制率。

病毒抑制率

式中，孔中接种细胞、未加入病毒和样品的组别为对照组，孔中接种细胞、加入病毒、未加入样品的组别为空白组。

1.7 GFWE对EV71病毒衣壳蛋白(VP1)编码基因mRNA表达水平影响的测定

将细胞铺于6孔板中，待细胞生长至孔板底面积的80%时加入MOI=1的EV71病毒液，病毒吸附2 h后将上清液更换为2%(体积分数)DMEM、利巴韦林和25～400 μg·mL-1 GFWE。培养16 h后将上清液更换成1 mL Trizol细胞裂解液进行反复吹打，待细胞裂解后转移至离心管中，按照通用型总RNA提取试剂盒说明书的步骤提取RNA。用核酸蛋白测定仪测定总RNA的D260 nm/D280 nm,确定纯度和含量后使用gDNA清除试剂盒反转成cDNA,使用荧光定量PCR试剂盒测定mRNA的表达水平。通过网站对引物进行设计，引物序列如表1所示。 

表1 EV71病毒相关基因PCR引物序列 

1.8 数据处理

试验数据均为至少3次平行重复的平均值±标准差。采用Microsoft Office Excel 2010、GraphPad Prism 7.00等软件对数据进行处理。

2、结果与分析

2.1 GFWE化学成分组成

2.1.1 总糖和蛋白质含量

以葡萄糖为标准品，采用苯酚硫酸法获得标准曲线方程y=4.452 4x+0.177 3(R2=0.996 0);使用BCA蛋白定量试剂盒获得蛋白质含量的标准曲线方程y=0.001 0x-0.001 3(R2=0.998 5)。GFWE中总糖和蛋白质的质量分数分别为35.93%、32.97%。由此可知，GFWE中的主要化学成分为糖类物质和蛋白质。

2.1.2 主要化学成分

基于UPLC-MS/MS的总离子流图(图1),将GFWE二级质谱的结果与数据库进行匹配鉴定，共检测出336个化合物。其中，正离子模式下有215个化合物，负离子模式下有121个化合物，这些化合物主要包括112个氨基酸、肽及其衍生物(占相对丰度的78.61%),49个碳水化合物(占相对丰度的16.85%),47个脂类化合物(占相对丰度的2.00%),28个核苷酸类化合物(占相对丰度的4.20%)和21个维生素类化合物(占相对丰度的2.46%)等。由表2可知，GFWE中的蛋白质主要由L-异亮氨酸、L-络氨酸、L-苯丙氨酸、γ-氨基丁酸、L-赖氨酸、L-组氨醇、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、哌啶酸、L-蛋氨酸亚砜、L-色氨酸和β-亮氨酸等13种氨基酸组成。此外，在GFWE中还检测出哌啶、脱氧尿苷、甘露醇和马来酰胺酸等其他化合物。

图1 GFWE的正离子模式(A)和负离子模式(B)的总离子流图  

表2 GFWE主要化学成分的UPLC-MS/MS检测结果

图2 GFWE的高效凝胶渗透色谱

2.1.3 分子质量

采用高效凝胶渗透色谱法测定GFWE的分子质量。结果(图2)显示，GFWE的相对分子质量较低，出现4个吸收峰，保留时间分别为41.19、42.18、43.13、50.52 min, 提示GFWE含有4个不同分子质量的组分，峰1、2、3、4的重均分子质量分别为15.67、10.10、6.60 ku和<1.00 ku。

2.1.4 多糖组成

对16种单糖标准品的出峰时间进行对比分析，结果(图3、表3)显示，GFWE主要由葡萄糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖和古罗糖醛酸4种单糖组成，其物质的量比为0.907∶0.038∶0.029∶0.026。值得注意的是，葡萄糖含量最高，其次是半乳糖。

2.2 GFWE对Vero细胞增殖能力的影响

采用CCK-8法测定GFWE对Vero细胞的毒性，并确定GFWE的安全给药量。结果(图4)显示，GFWE处理48 h对Vero细胞无明显毒性。25～200 μg·mL-1 GFWE处理48 h, Vero细胞的存活率均接近正常细胞，无显著差异；400 μg·mL-1 GFWE会显著促进Vero细胞的增殖(P<0.05);800～3 200 μg·mL-1 GFWE会极显著促进Vero细胞的增殖(P<0.01)。细胞极显著增殖无法准确判断GFWE对EV71病毒的抑制作用，故本研究选择25～400 μg·mL-1 GFWE进行后续抗病毒活性研究。

图3 GFWE多糖组成的离子色谱  

表3 GFWE的多糖组成

2.3 GFWE对感染EV71病毒的Vero细胞的影响

图4 GFWE对Vero细胞增殖能力的影响   

图5显示，用EV71病毒感染Vero细胞后，模型组的细胞颗粒明显增多，大多数变圆且漂浮，细胞活力明显下降。与病毒模型组相比，利巴韦林和GFWE处理后的绝大部分细胞呈贴壁状态，表明利巴韦林和GFWE能够抑制细胞形态的改变以及细胞数量的减少，从而抑制病毒感染。

2.4 GFWE对EV71病毒的抑制率

以100 μg·mL-1利巴韦林为阳性对照，不同含量GFWE对EV71病毒的抑制率(图6)表现为：25 μg·mL-1 GFWE对EV71病毒的抑制率(50.29%)显著高于阳性对照组(42.78%)(P<0.05);50、100、200 μg·mL-1 GFWE对EV71病毒的抑制率分别为76.15%、91.32%、91.83%,极显著高于阳性对照组(P<0.01);400 μg·mL-1 GFWE对EV71病毒的抑制率为47.47%,与阳性对照组无明显差别。这表明25～400 μg·mL-1 GFWE对EV71病毒具有不同程度的抑制作用，50～200 μg·mL-1 GFWE具有较高的抗病毒活性。

图5 Vero细胞形态变化的显微结构(×40)  

图6 GFWE对EV71病毒的抑制率   

2.5 GFWE对EV71 VP1 mRNA表达水平的影响

在EV71病毒感染Vero细胞后加入GFWE进行干预，16 h后使用Trizol细胞裂解液提取总RNA,采用荧光定量PCR检测GFWE对EV71 VP1 mRNA表达水平的影响。结果(图7)显示，与模型对照组(EV71)相比，利巴韦林阳性对照组和25～400 μg·mL-1 GFWE组的EV71 VP1 mRNA的表达水平均极显著下降(P<0.01)。200 μg·mL-1 GFWE组VP1 mRNA的表达水平显著低于阳性对照组(P<0.05)。25～200 μg·mL-1 GFWE组呈剂量依赖性。这表明25～400 μg·mL-1 GFWE能明显抑制病毒吸附后的复制过程，能够与EV71 VP1相结合，从而阻止病毒附着在细胞上及进入细胞。

图7 GFWE对EV71 VP1 mRNA表达水平的影响

3、讨论

水提醇沉法是指在水提溶液中加入乙醇使得多糖等大分子质量成分在醇溶液中的溶解度下降而析出沉淀，而醇沉制备多糖的副产物上清液中还含有丰富的低分子质量多糖和蛋白质等[24]。研究表明，低分子质量多糖和蛋白肽因分子质量低、水溶性好，更容易被机体吸收和利用。如：Zhou et al[25]研究表明，经过超声波降解的具有更低分子质量的紫菜多糖表现出更高的抗氧化活性；Liu et al[26]从灵芝中分离纯化得到两种具有高抗氧化活性，分子质量分别为5.2、15.4 ku的均一化多糖GLPL1和GLPL2,GLPL1清除自由基及Fe2+螯合效果更好；王天明等[27]研究表明，海地瓜中的低分子质量多肽能明显降低细胞的氧化损伤程度。本研究结果表明：GFWE主要由低分子质量多糖、氨基酸、肽及其衍生物组成，含有78.61%氨基酸、肽及其衍生物，16.85%碳水化合物，2.00%脂类化合物，4.20%核苷酸类化合物和2.46%维生素类化合物等；GFWE中主要的蛋白质由L-异亮氨酸、L-络氨酸、L-苯丙氨酸、γ-氨基丁酸、L-赖氨酸、L-组氨醇、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、哌啶酸、L-蛋氨酸亚砜、L-色氨酸和β-亮氨酸等组成。杨开等[24]研究表明，灰树花多糖醇沉上清液含有丰富的蛋白资源，并从中分离出17种氨基酸，其中7种为必需氨基酸。本研究提取的GFWE富含13种氨基酸，其中也包含7种必需氨基酸。Baltina et al[28]研究表明，甘草酸与L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸等氨基酸的合成物对甲型H1N1流感病毒表现出较强的抑制效应。此外，本研究在GFWE中还检测出哌啶、脱氧尿苷、甘露醇和马来酰胺酸等其他化合物。多糖的分子质量、溶解度、黏度和糖类型等因素与其生物活性和结构特征密切相关[29]。本研究检测出GFWE中的多糖由葡萄糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖和古罗糖醛酸4种单糖组成，其物质的量比为0.907∶0.038∶0.029∶0.026,重均分子质量分别为15.67、10.10、6.60 ku和<1.00 ku。陈向东等[30]从灰树花菌丝体粗提物中分离纯化出一种低分子质量多糖，其具有明显的抗肿瘤作用；乔彦茹等[31]研究表明，分子质量<8 ku的灰树花多糖能明显刺激巨噬细胞分泌NO。本研究评估GFWE对感染了EV71病毒的Vero细胞的保护作用，发现GFWE对EV71病毒的抑制作用较强，100、200 μg·mL-1 GFWE对病毒的抑制率分别为91.32%、91.83%;在EV71 VP1 mRNA的表达水平上，200 μg·mL-1 GFWE处理显著低于阳性对照利巴韦林(P<0.05),表明200 μg·mL-1 GFWE抗EV71病毒的效果最好。推测富含低分子质量多糖和氨基酸的GFWE因其水溶性强，更易通过组织屏障进入细胞内部或附着在受体上，可在一定程度上抑制EV71病毒对Vero细胞的吸附和入侵，从而有效地保护Vero细胞。

综上所述，GFWE主要由低分子质量多糖、氨基酸、肽及其衍生物组成，具有较高的抗EV71病毒活性，能够抑制感染了EV71病毒的Vero细胞中VP1的合成。在后续的研究中将探讨GFWE在体内的抗EV71病毒活性，并进一步阐明其抗病毒的分子机制。

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基金资助:福建农林大学营养与功能性食品服务团队项目(11899170148);福建省科学技术厅区域发展项目(2020N3002);福建省科学技术厅对外合作项目(2021I0008);福建省重大专项(2021NZ0101);

文章来源:林震山,熊雯宇,何君强,等.灰树花水溶物对EV71病毒的抑制作用[J].福建农林大学学报(自然科学版),2024,53(03):410-418.