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基于酶功能化量子点的人尿液胰蛋白酶传感器

2024-12-04 48 上传者：管理员

摘要：以葡萄糖氧化酶（GOD）为模板，制备了GOD功能化的锰掺杂硫化锌（GOD-Mn-ZnS）量子点（QDs）,并通过正交实验对QDs的合成条件进行优化。构建了一种检测胰蛋白酶的磷光传感体系，实现了对人体尿液中胰蛋白酶的定量检测。实验结果表明，QDs的磷光猝灭程度与胰蛋白酶的浓度呈良好的线性关系，线性范围为5～100 mg/L,R2=0.998,检出限为2.21 mg/L。采用标准加入法对健康志愿者的尿液进行检测，加标回收率为97.45%～103.00%。该方法可用于急性胰腺炎患者尿液中胰蛋白酶的快速检测，具有良好的生物医学应用前景。

关键词：
消化系统
生物医学传感器
胰蛋白酶检测
酶功能化
量子点
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胰蛋白酶是一种重要的碱性蛋白酶，广泛存在于动物的消化系统中，它的异常激活会导致许多疾病，如胰腺炎、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、胆道癌等[1,2]。目前，人体尿液中的胰蛋白酶水平已作为诊断胰腺疾病的生物标志物[3],已报道的胰蛋白酶检测方法包括质谱仪[4]、凝胶电泳[5]、酶联免疫吸附实验[6]、电化学分析[7]、比色测定[8]等，然而这些方法都存在设备昂贵、操作复杂、检测时间长等缺点。因此，急需开发出一种方便、快速、灵敏检测胰蛋白酶的方法。

由于量子点(quantum dots, QDs)具有宽吸收和对称光致发光光谱、耐光漂白等优点，成为了制备生物传感器的理想材料[9]。目前，QDs主要是通过有机相的方式合成，需要进行配体交换使其具有亲水性。对于生物应用，还需对其进行生物偶联，这是一个费力复杂的过程[10]。近年来，有人基于生物矿化合成了蛋白质功能化QDs,但需要在较高的pH环境下制备，这导致了蛋白质的活性降低甚至丧失[10,11]。酶是一类生物催化剂，在物质代谢中发挥着重要作用。因此，可以将生物酶与QDs结合用来构建生物传感器。

本文制备了葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)功能化锰掺杂硫化锌(Mn-ZnS)量子点(QDs)。并且，基于胰蛋白酶对GOD的水解作用，Mn-ZnS QDs发生聚集，导致QDs磷光猝灭。通过磷光猝灭程度对胰蛋白酶进行检测，并将该探针用于人体尿液中胰蛋白酶的直接定量检测。

1、实验部分

1.1试剂与仪器

试剂：GOD、硫化钠(Na2S)、无水醋酸锌(Zn(CH3COO)2)、四水醋酸锰(Mn(CH3COO)2·4H2O)、胰蛋白酶等购自上海阿拉丁有限公司。

仪器：台式70全温振荡培养箱ZQTY—70S(上海知楚仪器有限公司),荧光分光光度计LS—55(Perkin Elmer公司),高分辨型扫描透射电子显微镜JEM—2010(德国Hitachi公司),圆二色谱仪(英国应用光学物理公司)。

1.2实验原理

首先，利用生物矿化作用制备GOD功能化的Mn-ZnS QDs;接着，在胰蛋白酶存在时，QDs表面的GOD被分解成蛋白质小片段或氨基酸，使QDs发生聚集，导致其磷光猝灭(图1)。

图1实验原理

1.3实验步骤

1.3.1 GOD功能化Mn-ZnS QDs的制备

将75μL GOD(10 g/L)、20μL Mn(CH3COO)2·4H2O(1 mmol/L)、40μL Zn(CH3COO)2(20 mmol/L)、50μL Tris-HCl溶液(pH=6.5,0.1 mol/L)加入到325μL超纯水中。在37℃摇床下缓慢搅拌10 min。然后将40μL Na2S(20 mmol/L)快速注入上述前体溶液中，之后轻轻搅拌90 min。从而获得GOD封端的Mn-ZnS QDs。

1.3.2胰蛋白酶的检测

向500μL Mn-ZnS QDs溶液中添加200μL不同浓度(0～100 mg/L)的胰蛋白酶溶液，再用Tris-HCl溶液(pH=6.5)定容至2 mL。将混合物在37℃下孵育45 min,最后用荧光分光光度计记录其磷光强度，激发波长为450 nm,发射波长扫描范围为480～650 nm。

2、结果与讨论

2.1 QDs合成条件的优化

2.1.1单因素实验

本文对制备时间、pH值、温度、酶投料、n(S2-)︰n(Zn2+,Mn2+)、n(Zn2+)︰n(Mn2+)进行了优化。从图2(a)中可以看出，反应90 min时QDs磷光达到最强。如图2(b)所示，不同n(S2-)︰n(Zn2+,Mn2+)会影响QDs的磷光强度，这可能是因为过低或过量的S2-会增加QDs表面缺陷导致磷光减弱[12,13]。如图2(c)所示，QDs磷光强度先增后减，在n(Zn2+)︰n(Mn2+)为40︰1时达到最强。这是由于开始时的磷光由ZnS自发光和Mn2+的中心发光组成，随着Mn2+浓度的增加，Mn2+会在QDs表面捕获电子，从而导致磷光衰减[14]。从图2(d)中可以看出，37℃时磷光最强。如图2(e)所示，pH值会影响S2-、H+及氨基酸残基之间的平衡，增加QDs表面的缺陷，导致磷光减弱[14]。如图2(f)所示，酶投料为0.75 mg时磷光最强。这是因为GOD浓度过低或过高时，QDs的产量会相对减少。

图2 QDs合成条件的优化

2.1.2正交实验

通过单因素实验，选取了如表1所列的温度、pH值、n(S2-)︰n(Zn2+,Mn2+)和GOD投料4个因素进行研究，且根据因素的可变性范围对实验水平进行了分类。根据条件选择了L16正交阵列如表2所示。实验结果表明，制备Mn-ZnS QDs的最佳条件为：温度37℃,pH值为6.5,n(S2-)︰n(Zn2+,Mn2+)为1,GOD投料0.75 mg,n(Zn2+)︰n(Mn2+)为40︰1。

表1实验使用的因素及水平(n=3)

表2 L16正交实验结果与分析

2.2 QDs的表征

2.2.1形态与结构表征

图3(a)显示，制备的Mn-ZnS QDs保留着GOD在265 nm左右的特征吸收，表明了Mn-ZnS QDs表面包裹着GOD。最大磷光发射波长位于533 nm处。从图3(b)中可以看到近球形和单分散的Mn-ZnS QDs,平均直径约为(3.0±0.2)nm。

图3 Mn-ZnS QDs的表征

2.2.2量子产率的测定

选取异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)为参比溶液，采用相对法测定Mn-ZnS QDs的量子产率。记录5个不同浓度QDs的磷光光谱如图4(a),并对其积分面积进行线性拟合处理如图4(b)。之后根据式(1)计算QDs的相对量子产率

式中ΦQDs为QDs的量子产率，ΦFITC为FITC在0.1 mol/L NaOH中的量子产率(96 %),ηH2O为超纯水的折光指数(1.333 3),ηNaOH为0.1 mol/L NaOH的折光指数(1.475)。计算得到Mn-ZnS QDs的量子产率高达43 %。

图4量子产率的测定

2.2.3稳定性考察

图5为QDs在不同温度、盐浓度及存放天数下的磷光强度，可以看出QDs的磷光强度基本不变，表明所合成的Mn-ZnS QDs具有很强的稳定性。

图5 Mn-ZnS QDs的稳定性考察

2.3酶活性检测

为考察合成Mn-ZnS QDs后酶活性是否受到影响，本文比较了合成QDs后GOD和游离GOD的米氏常数Km。通过Lineweaver-Burke曲线及酶—底物反应的斜率可以计算出GOD的米氏常数

式中V为酶促反应速度；Km为酶和底物的亲和程度；Vmax为酶活性位点被底物饱和时的最大反应速率；[S]为底物浓度，mmol/L。

据Wu P等人报道[15],游离GOD的Km值为1.3 mmol/L。通过计算，合成Mn-ZnS QDs后GOD的Km值为0.158 mmol/L,说明了GOD与底物的亲和能力有所加强。通常，蛋白质的生物活性与其二级结构相关，由图6(c)可知，游离的GOD在波长208 nm和220 nm处具有2个明显的蛋白质本征构象特征带，合成Mn-ZnS QDs后GOD原有的特征带基本不变，表明了合成QDs之后GOD的构象并没有发生变化[16]。说明合成Mn-ZnS QDs不会影响GOD的活性。

图6葡萄糖浓度对Mn-ZnS QDs的磷光强度的影响

2.4 Mn-ZnS QDs生物传感器检测胰蛋白酶的性能测试

2.4.1线性范围、灵敏度和检出限

本文考察了Mn-ZnS QDs磷光传感器检测胰蛋白酶的能力，如图7(a)所示，随着胰蛋白酶的浓度的增加，QDs的磷光逐渐降低，胰蛋白酶浓度为100 mg/L时，由公

式计算得到磷光猝灭效率达到了78.26 %。式中的P0和P分别为加入胰蛋白酶溶液前后的磷光强度。图7(b)为磷光猝灭效率与胰蛋白酶浓度在5～100 mg/L范围内呈良好的线性关系。线性方程为y=0.038x+0.959(R2=0.997)。通过公式计算得到检出限为2.21 mg/L。其中，SD为标准方差，K为标准曲线的斜率。

图7 Mn-ZnS QDs对胰蛋白酶的分析性能

2.4.2特异性考察

向QDs溶液中加入100倍的胰蛋白酶类似物及尿液中的一些干扰物如牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、K+、Ca2+、Na+、Mg2+等。图8表明干扰物质对Mn-ZnS QDs的磷光几乎没有影响。因此，本文所构建的GOD功能化Mn-ZnS QDs传感器对胰蛋白酶具有良好的特异性。

图8干扰物质对Mn-ZnS QDs磷光的影响

2.5实际样品分析

在健康志愿者的尿液中加入一定量的胰蛋白酶，用图7的标准曲线进行定量分析。测定的回收率在97.45 %～103.00 %范围内。表明了本文的Mn-ZnS QDs传感器对尿液中胰蛋白酶的检测有良好的准确度和精密度。

表3健康志愿者尿样中胰蛋白酶的测定(n=3)

3、结论

本文制备了GOD功能化的Mn-ZnS QDs。通过对实验条件的优化，合成的QDs具有优异磷光特性和稳定性。基于胰蛋白酶的水解特性，构建了一种室温检测人体尿液胰蛋白酶的磷光传感器。该传感体系在胰蛋白酶的快速检测方面具有一定的应用潜力，有望成为急性胰腺炎患者尿液中胰蛋白酶快速检测的方法。

参考文献:

[14]吕金枝,张鑫浩.胆碱氧化酶功能化室温磷光量子点的制备及其对氯化胆碱的定量检测[J].应用化学,2022,39(5):828-836.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(21804146,22004134);湖北省自然科学基金资助项目(2023AFB799);中央高校基本科研业务费专项资金项目(CPT22022);横向项目(HZY22110);