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平滑肌细胞gp130在腹主动脉瘤中的作用机制研究

2024-12-17 137 上传者：管理员

摘要：目的探讨IL-6细胞因子家族的共受体糖蛋白130（glycoprotein 130,gp130）对血管平滑肌细胞表型和腹主动脉瘤的影响，挖掘腹主动脉瘤防治的潜在新靶点。方法使用他莫昔芬[0.1 mg/（g•d）]对Sm22-ER-Cre+gp130loxP/loxP小鼠连续腹腔注射5 d的方法诱导平滑肌细胞gp130的敲除。选取8周的平滑肌细胞gp130特异性敲除（CKO）和对照小鼠各17只，两组小鼠均通过联合Pcsk9腺相关病毒尾静脉注射(1×1011 v.g.)、高脂饲喂和血管紧张素II灌注[1 000 ng/（min•kg）,28 d]制备小鼠腹主动脉瘤模型。血管超声检测腹主动脉直径变化，腹主动脉最大外径超过造模前小鼠的50%则判定为腹主动脉瘤形成。EVG染色检测血管弹力板断裂情况。实时定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化染色检测血管的收缩相关基因及炎症相关基因的表达。胶原收缩实验检测小鼠原代血管平滑肌细胞的收缩功能。结果与对照组相比，CKO小鼠腹主动脉瘤发生率降低（P<0.05）、血管直径下降（P<0.05）、弹力板断裂情况改善。CKO小鼠主动脉收缩相关基因（α-Sma、Sm22等）表达上调、炎症相关基因（Ccl2、Il-6等）下调、炎症细胞浸润减少。与对照细胞相比，分离的CKO原代血管平滑肌细胞收缩功能增强（P<0.05）。结论平滑肌细胞特异性敲除gp130通过维持平滑肌细胞收缩表型和收缩功能、减轻血管炎症，在腹主动脉瘤进展中发挥保护作用。

关键词：
gp130
平滑肌表型
收缩功能
腹主动脉瘤
血管炎症
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腹主动脉瘤是主动脉下段退行性改变和扩张的一种潜在致命的主动脉疾病，目前尚无有效的药物治疗手段。腹主动脉瘤的病理特征包括血管炎症、细胞外基质破坏以及血管平滑肌细胞收缩功能的丧失[1]。血管平滑肌细胞的稳态在主动脉瘤中起着重要作用。平滑肌细胞收缩表型丧失已被认为是多种动物模型和人类动脉瘤组织中的早期事件[2]。血管平滑肌细胞具有高度的表型可塑性，丧失收缩表型导致血管收缩功能受损。此外，发生表型转化的平滑肌分泌更多的炎症因子和金属蛋白酶，加重血管炎症和细胞外基质降解，促进动脉瘤的进展。然而，调控血管平滑肌细胞表型转化的信号通路需要进一步阐明。

IL-6细胞因子家族包括IL-6、IL-11、IL-27、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、纤毛神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)等多个成员。信号转导糖蛋白130(glycoprotein, gp130)是这些家族成员的共受体，因此这些因子也被称为gp130受体配体或gp130细胞因子。越来越多的研究证据表明，IL-6家族细胞因子与腹主动脉瘤的发生发展相关[3-4]。虽然这些研究阐明了不同的IL-6家族细胞因子在腹主动脉瘤中的作用，作为IL-6细胞因子家族的共受体，gp130对平滑肌细胞功能及腹主动脉瘤的影响尚不清楚。

为此，本研究利用平滑肌细胞特异性gp130敲除小鼠建立腹主动脉瘤模型，明确平滑肌细胞gp130对腹主动脉瘤发生发展的影响；通过检测血管、原代血管平滑肌细胞的基因表达和收缩功能，明确gp130对血管平滑肌细胞收缩表型的调控作用。以期解析gp130影响腹主动脉瘤发生发展的作用及机制，挖掘腹主动脉瘤防治新靶点。

1、材料和方法

1.1主要材料和试剂

(1)动物：

构建平滑肌细胞特异性敲除gp130小鼠。将gp130loxp/loxp小鼠(由广州市赛业生物技术有限公司构建)与Sm22-ER-Cre工具鼠(北京唯尚立德公司)进行交配繁殖，得到Sm22-ER-Cre+gp130loxp/loxp(CKO)小鼠及同窝Sm22-ER-Cre-gp130loxp/loxp(对照)小鼠。使用他莫昔芬[0.1 mg/(g·d)]连续注射5 d诱导平滑肌细胞gp130敲除。选用8周雄鼠用于实验，每组17只鼠。实验小鼠饲养在SPF级环境，温湿度适宜，饮食清洁。本实验得到首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会批准。

(2)原代血管平滑肌细胞分离培养：

将小鼠胸主动脉(从主动脉根到隔膜)分离出来，去除外膜。将主动脉组织纵向剖开，然后用消化缓冲液(1 mg/mL I型胶原酶)孵育15 min。然后将主动脉切成1 cm2的小片，并在含有20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及生长因子的培养基中培养，直到平滑肌细胞从组织中生长出来。细胞在第3～8代被用于进一步的实验。

(3)试剂：

血管紧张素II、他莫昔芬购自美国Sigma公司；Pcsk9腺相关病毒(Pcsk9 adeno-associated virus, Pcsk9-AAV)购自上海吉凯公司；高脂饲料购自北京华府康生物科技有限公司；I型胶原酶、大鼠鼠尾胶原购自美国Gibco公司；EVG染色液购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；mRNA反转录试剂盒购自美国Promega公司；渗透式泵(型号2004)购自美国Alzet公司；组织蛋白裂解液购自美国Thermo Fisher公司；抗体均购自美国Abcam公司；PCR引物由北京诺赛基因有限公司合成。

1.2腹主动脉瘤模型制备

8周小鼠他莫昔芬诱导后，尾静脉注射Pcsk9腺相关病毒(1011v.g.)后喂饲4周的高脂饮食饲料。1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后将含血管紧张素II的渗透式泵[1 000 ng/(min·kg)]植入小鼠皮下，并持续喂饲高脂饲料，灌注28 d后进行血管超声等后续实验。

1.3血管超声

将小鼠用1%异氟醚麻醉，从胸部到腹部剃毛。使用配备有30 MHz探头的超声系统(Vevo 2100,VisualSonics)进行超声扫描。对主动脉进行了短轴和长轴扫描，从左肾动脉支的水平到肾上腺区域。造模28 d后，腹主动脉最大直径至少比造模前的腹主动脉扩张50%,则被认定为腹主动脉瘤。

1.4免疫组织化学染色及病理染色

对于免疫组织化学染色，冰冻切片先用3%过氧化氢孵育，然后用3%血清进行封闭。切片在4°C孵育过夜与抗MYH11和Mac2的一抗结合，随后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，最后通过DAB进行显色。病理染色，冰冻切片使用EVG染色试剂盒，检测对弹力板的影响。

1.5实时定量PCR (qRT-PCR)

总RNA使用TRIzol试剂提取。相同量(1～3μg)的RNA反转录成cDNA。实时荧光PCR扩增使用CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad)。引物序列见表1。

1.6蛋白免疫印迹(Western blot)

使用蛋白裂解液提取小鼠主动脉或血管平滑肌细胞的总蛋白并进行蛋白浓度测定。相同量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝基纤维素膜上。膜用一抗gp130、SM22、α-SMA、GAPDH和IRDye标记的二抗进行孵育。使用Odyssey红外成像系统检测免疫荧光信号，并用Image J软件进行定量分析。

1.7胶原收缩实验

将悬浮在完全培养基中的血管平滑肌细胞与胶原溶液混合。最终浓度为5×105细胞/mL,1×MEM,8% FBS,20 mM HEPEs和2.0 mg/mL大鼠尾胶原蛋白。然后将200μL混合液放入24孔平底组织培养板中，在37℃下固化1 h。固化后，加入500μL完全培养基覆盖胶原凝胶。将培养板在37℃、5% CO2条件下培养24 h,通过使用Image J软件测量凝胶表面积来确定细胞的收缩能力，并表示为收缩指数ΔA/A0,其中凝胶面积的减少(ΔA=A0-At)归一化为t=0时的初始凝胶面积(A0)。

1.8统计分析

使用GraphPad Prism 7.0软件(GraphPad Software)进行统计分析。首先使用Shapiro-Wilk正态性检验评估数据是否呈正态分布。对于正态分布的数据的两组比较，采用Student’st检验，如果数据的标准差不相等，则使用Welch校正通过F检验。当数据不符合正态分布时，使用非参数检验。对于腹主动脉瘤的发生率，使用Fisher确切性检验。所有数据以均值±标准差呈现。P<0.05,被认为差异具有统计学意义。

表1 qRT-PCR引物序列

2、结果

2.1敲除平滑肌细胞gp130延缓腹主动脉瘤发生发展

利用Pcsk9腺相关病毒、高脂喂养和血管紧张素II灌注进行腹主动脉瘤造模，见图1。对照小鼠腹主动脉瘤的发生率为29.4%。与对照组相比，平滑肌细胞特异性敲除gp130(CKO组)降低了腹主动脉瘤发生率(P<0.05),见图2(a)。多普勒超声显示CKO组小鼠腹主动脉直径降低，见图2(b)。血管大体图显示对照组小鼠腹主动脉有明显扩张，CKO组小鼠腹主动脉病变减轻，见图3(a)。进一步，EVG染色显示对照组小鼠腹主动脉弹力板断裂和血管重构，平滑肌细胞特异性敲除gp130则改善了血管病变，见图3(b)。这些结果证实敲除平滑肌细胞gp130延缓腹主动脉瘤发生发展。

图1腹主动脉瘤造模示意图

图2腹主动脉瘤发生率(a)和腹主动脉最大血管直径(b)

图3主动脉大体图(a)和EVG染色(b)

2.2敲除gp130维持血管平滑肌细胞的收缩表型

平滑肌细胞收缩表型的丢失是腹主动脉瘤一个重要病理特征，也是影响腹主动脉瘤发生发展的关键病理机制。为了解析敲除平滑肌细胞gp130减轻腹主动脉瘤的分子机制，课题组聚焦到平滑肌细胞收缩表型。在腹主动脉瘤造模后，收集小鼠血管组织进行以下实验。蛋白免疫印迹分析显示CKO小鼠血管收缩表型标志基因α-SMA和SM22蛋白水平显著升高，见图4。实时定量PCR同样表明CKO小鼠血管收缩表型标志基因α-Sma、Sm22和共转录因子Myocd的mRNA水平显著升高，见图5。免疫组化染色显示对照小鼠腹主动脉血管MYH11表达较低，CKO小鼠MYH11阳性的中膜细胞明显增多，见图6。这些结果提示敲除gp130改善了血管平滑肌细胞的收缩表型，可能发挥抵抗腹主动脉瘤的保护作用。

图4主动脉收缩相关蛋白表达水平

图5主动脉收缩相关基因mRNA表达水平

图6主动脉MYH11免疫组化染色

2.3 gp130敲除的血管平滑肌细胞收缩功能增强

平滑肌细胞收缩表型的丢失伴随着细胞收缩功能的受损。为了明确敲除平滑肌细胞gp130对细胞收缩功能的影响，课题组分离了对照和CKO小鼠的原代血管平滑肌细胞。蛋白免疫印迹显示CKO小鼠的血管平滑肌细胞gp130蛋白水平明显降低，见图7。胶原收缩实验显示，gp130缺失的血管平滑肌细胞收缩功能显著增强(P<0.01),见图8。这些结果说明敲除gp130提高了血管平滑肌细胞的收缩功能，可能抵抗了腹主动脉瘤的发生发展。

图7原代血管平滑肌细胞GP130蛋白水平

图8原代血管平滑肌细胞胶原收缩实验及统计

2.4平滑肌细胞gp130缺失降低血管炎症水平

增加的炎症细胞浸润和炎症因子水平是腹主动脉瘤的病理特征之一。为了明确敲除gp130对血管炎症的影响，通过qRT-PCR检测血管炎症因子表达。与对照小鼠相比，CKO小鼠血管炎症因子Ccl2、Il6、Il1β明显降低，Tnfα无明显变化，见图9。通过免疫组化对浸润的巨噬细胞进行检测，发现在对照小鼠的腹主动脉有明显的MAC2阳性巨噬细胞浸润，而CKO小鼠腹主动脉MAC2阳性巨噬细胞显著减少(P<0.05),见图10。这些结果说明，敲除平滑肌细胞gp130减轻了血管炎症因子水平和炎症细胞浸润。

图9主动脉炎症相关基因mRNA表达水平

3、讨论

本研究利用平滑肌细胞特异性gp130敲除鼠、血管紧张素II灌注和高脂血症的腹主动脉瘤模型，结合体外原代血管平滑肌细胞实验，证实敲除平滑肌细胞gp130维持了血管平滑肌细胞的收缩表型和收缩功能、减轻血管炎症，抵抗腹主动脉瘤的发生。

图10主动脉MAC2免疫组化染色及统计

高血清IL-6水平与小直径腹主动脉瘤的迅速扩张相关[5]。IL-6受体(IL-6R)基因中的一种常见的非同义功能变异(Asp358Ala),减弱了IL-6受体的信号传导，降低了冠心病和主动脉瘤的风险[6]。除了IL-6,其他IL-6家族的细胞因子也参与了动脉瘤的发生发展。急性胸主动脉夹层患者的胸主动脉和血浆中IL-11的浓度增加[7]。敲除IL-27R可以抑制血管紧张素II诱导的腹主动脉瘤形成[8]。本研究则首次阐明平滑肌细胞的IL-6细胞因子家族共受体gp130信号在腹主动脉瘤进展中的有害作用。

IL-6结合受体有两种，一种是特异性受体IL-6R,另一种是共受体gp130。gp130可以在所有细胞表达，但IL-6R的表达受到更多的限制，主要发现于肝细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和CD4+ T细胞。IL-6受体gp130的二聚化会导致两种细胞内信号通路的启动：经典信号通路和转导信号通路。IL-6R可以在细胞膜经过蛋白质水解，形成可溶性的IL-6R(sIL-6R),也可以在翻译阶段进行剪接mRNA,进而产生sIL-6R。在经典信号通路中，IL-6与膜上的IL-6R结合，随后与细胞膜上的gp130结合，启动细胞内信号传导。在IL-6转导信号通路中，IL-6与sIL-6R结合，形成IL-6/sIL-6R复合物与细胞膜gp130结合，从而引发细胞内信号。这两种途径的生物学后果有很大差异，通过膜结合受体的经典IL-6信号通路主要是再生和保护性的，可溶性IL-6R的IL-6转导信号通路是促炎症的。由于平滑肌细胞不表达膜IL-6R,因此只存在IL-6转导通路。IL-6转导通路是促炎症的[9]。本研究的结果中，同样发现敲除平滑肌细胞gp130阻断转导通路，减轻了血管炎症细胞浸润和炎症因子水平，这提示IL-6转导通路不仅损害了平滑肌的收缩表型，还可能促进平滑肌细胞向炎症型细胞转化。可溶性gp130(sgp130)可与IL-6/sIL-6R复合物结合，并阻断IL-6转导通路[10]。据报道在血管紧张素II+TGF-β抗体诱导的腹主动脉瘤模型中，给与sgp130可减少主动脉瘤破裂[11]。另外，巴多昔芬(bazedoxifene),gp130的一种新型小分子抑制剂，也可显著减轻载脂蛋白E敲除小鼠动脉瘤的严重程度[12]。这些研究表明，靶向gp130可能是治疗腹主动脉瘤的潜在策略。

研究的局限性：本研究只使用了一种腹主动脉瘤模型制备方法，只能说明敲除平滑肌细胞gp130延缓了此种类型的腹主动脉瘤发生发展。在后续的研究中，课题组将采用其他腹主动脉瘤造模方法，如弹力蛋白酶灌注法，验证平滑肌细胞gp130的作用。

4、结论

本研究首次证实了平滑肌细胞gp130缺失降低腹主动脉瘤发生率、抑制腹主动脉扩张的保护作用；首次明确gp130通路调控平滑肌细胞收缩表型，影响血管炎症和腹主动脉瘤发生发展的作用机制。研究拓展了对腹主动脉瘤分子病理的认识，为疾病的防治提供潜在靶点。

基金资助:国家自然科学基金(32200925､81930014);北京市自然科学基金(7232012)资助;

文章来源:韩迎春,杨雨琪,李玉琳,等.平滑肌细胞gp130在腹主动脉瘤中的作用机制研究[J].北京生物医学工程,2024,43(06):592-597+640.