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糖尿病肾病应用加味芪黄饮的作用及其机制研究

2020-08-03 388 上传者：管理员

摘要：目的：研究加味芪黄饮治疗糖尿病肾病(DN)的作用及其机制。方法：雄性SD大鼠60只，随机分成正常对照组、模型对照组及加味芪黄饮低、高剂量组(400、800mg•kg-1•d-1)。以高糖高脂饮食及链脲佐菌素复制DN大鼠模型。给药12周后，测定各组大鼠24h尿白蛋白(24hUAlb)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素敏感指数(ISI)等指标，HE染色观察大鼠肾组织病理改变，WesternBlot法检测大鼠肾组织中胰岛素受体底物-1(IRS-1)的表达。结果：与模型对照组比较，加味芪黄饮低、高剂量组大鼠24hUAlb、Scr、BUN、FBG、FINS水平均较明显降低(P<0.05),ISI则明显升高(P<0.05)，且有一定的量效关系；能减轻DN大鼠肾小球肥大，系膜细胞、系膜基质弥漫增生等病理改变；使大鼠肾组织IRS-1表达明显升高(P<0.05)。结论：加味芪黄饮能保护DN大鼠的肾功能，减轻DN大鼠肾组织损伤，其可能通过上调IRS-1表达，以改善胰岛素抵抗状态而发挥作用。

关键词：
加味芪黄饮
糖尿病肾病
胰岛素受体底物-1
胰岛素抵抗
药学
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糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症，临床上以尿白蛋白升高和肾功能受损为主要表现，是导致终末期肾衰竭的常见原因之一。胰岛素抵抗及代偿性高胰岛素血症是DN发生发展的独立危险因素[1]，而胰岛素受体底物-1在改善IR中起至关重要的作用[2,3]。本课题组前期研究结果[4,5,6]表明，以益肾固精、化瘀清利为法的自拟方加味芪黄饮，在临床上治疗DN疗效确切，但其具体机制尚未阐明。本研究复制DN大鼠模型，观察加味芪黄饮对DN的治疗作用及其对IRS-1的影响，以期为加味芪黄饮治疗DN的作用机制提供参考。

1、材料与方法

1.1动物

3月龄SD大鼠，60只，雄性，SPF级，体质量（170±25)g，南方医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（粤）2018-0001。

1.2药物及试剂

加味芪黄饮由广州市中医医院中药制剂室提供；链脲佐菌素，美国Sigma公司，批号：S0130；碘[125I]胰岛素放射免疫分析试剂盒，北京科美东雅公司，批号：S20063082；兔抗IRS-1多克隆抗体，英国Abcam公司，批号：ab52167；辣根过氧化物酶标记的小鼠抗GAPDH单克隆抗体，上海康成生物工程有限公司，批号：KC-5G4;HRP标记的羊抗兔IgG，美国CST公司，批号：CST#5127;RIPA蛋白提取试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术公司；BCA-100蛋白质定量测定试剂盒，上海博彩生物科技有限公司。

1.3仪器

RM2135型石蜡切片机，德国LEICA公司；IX71型普通荧光倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；PT-1600E型匀浆机，瑞士KINEMATICA公司；多功能酶标仪，美国MolecularDevices公司；Mini-PROTEINSystem免疫印迹仪器，美国Bio-Rad公司；CANOSCAN5600F扫描仪，日本CANON公司；全自动生化分析仪，日本日立公司。

1.4DN大鼠模型的复制

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（15只）和DN模型组（45只）。正常对照组大鼠予普通饲料喂养。DN模型组大鼠予高糖高脂饮食（66.5%常规饲料+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐），喂养8周后，禁食24h，空腹状态下取1%STZ按45mg·kg-1·d-1一次性腹腔注射。1周后，内眦静脉取血测定大鼠空腹血糖及空腹胰岛素水平，并以此计算胰岛素敏感指数,ISI=Ln[1/（FBG×FINS）]。当FBG>7.8mmol·L-1，同时伴有ISI降低时，表明2型糖尿病大鼠模型建立成功[7]。STZ注射后2周，用代谢笼收集2组大鼠24h尿液，检测24h尿白蛋白（24hUAlb）水平，当24hUAlb>正常对照组均值3倍时，表明DN大鼠模型制备成功[8]。结果制备成功的大鼠模型共有39只。

1.5分组及给药方法

将DN大鼠随机分为模型对照组及加味芪黄饮低、高剂量组，每组各13只。加味芪黄饮低、高剂量组大鼠每日分别给予加味芪黄饮400、800mg·kg-1，正常对照组、模型对照组大鼠给予等量生理盐水，灌胃给药12周。

1.6血、尿生化指标检测

给药结束后用代谢笼收集大鼠24h尿液行24hUAlb定量。尾静脉取血，全自动生化分析仪检测各大鼠Scr、BUN、FBG等指标，放射免疫法检测大鼠FINS水平，并计算各大鼠ISI。

1.7肾组织HE染色检查

给药结束后检杀大鼠，取一侧肾脏置于10%福尔马林固定后，石蜡包埋备用。用切片机将肾组织制成厚度2μm切片，常规脱蜡后，进行HE染色，光镜下观察各组大鼠肾组织病理变化。

1.8Western

Blot检测肾组织中IRS-1蛋白表达检杀大鼠时，留取另一侧肾脏于液氮中保存备用。取部分肾组织，按1g∶100mL的比例置于RIPA裂解液中裂解，匀浆后离心提取蛋白质，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入兔抗IRS-1多克隆抗体（1∶1000）、HRP标记的小鼠抗GAPDH单克隆抗体（1∶10000),4℃孵育过夜，接着用HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000）室温孵育1h；最后加入ECL发光试剂，暗室中将膜贴在X光胶片下曝光、显影、定影，扫描胶片，并采用ImageJ图像分析软件进行蛋白条带灰度值分析。

1.9统计学处理方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（x±s）表示。多组比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD-t检验或Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠24hUAlb、Scr、BUN、FBG、FINS、ISI测定结果

与正常对照组相比，模型对照组大鼠24hUAlb、Scr、BUN、FBG、FINS水平均明显升高（P<0.05),ISI则明显下降（P<0.05）；与模型对照组比较，加味芪黄饮高、低剂量组大鼠24hUAlb、Scr、BUN、FBG、FINS水平均降低（P<0.05),ISI则升高（P<0.05），且随药物剂量增加，上述作用趋势更为显著（P<0.05）。结果见表1和表2。

表1加味芪黄饮对DN大鼠24hUAlb、Scr、BUN的影响

表2加味芪黄饮对DN大鼠FBG、FINS、ISI的影响

2.2各组大鼠肾组织病理变化

光镜下观察各组大鼠肾组织病理改变。正常对照组大鼠肾小球体积正常，系膜细胞、系膜基质未见增生，基底膜无增厚，肾小管形态结构正常。模型对照组大鼠肾小球肥大，肾小球囊腔呈裂隙状，系膜细胞、系膜基质弥漫增生，毛细血管袢塌陷或闭塞，肾小管管腔狭窄。加味芪黄饮高、低剂量组与模型对照组相比，上述病理损伤减轻，且随药物剂量增大，其损伤恢复程度更趋明显，见图1。

图1各组大鼠肾组织病理改变[HE染色，×200(A,B,C,D）；×400(E,F,G,H)]

2.3各组大鼠肾组织IRS-1蛋白表达变化

取各组大鼠肾组织标本行WesternBlot试验，检测肾组织中IRS-1蛋白的表达。与正常对照组相比，模型对照组大鼠肾组织IRS-1表达降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组比较，加味芪黄饮高、低剂量组大鼠肾组织IRS-1表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05），且随药物剂量增加，IRS-1升高更为明显（P<0.05）。见图2。

图2各组大鼠肾组织IRS-1蛋白的表达

3、讨论

糖尿病肾病（DN）可归属于祖国医学“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴[9]，属本虚标实之证，主要以五脏之气、血、阴、阳虚为本，以痰凝、湿浊、瘀血为标，因此其治疗应以益肾为本，固其封藏，正其开阖，兼以化痰除湿、活血通络。本课题组自拟方加味芪黄饮，以中医学治疗消渴虚劳名方六味地黄丸、参芪地黄汤等改良而成。方中以黄芪为君，补气利水，摄血藏精；臣以太子参补中益气，生津复血，生地、山茱萸、山药、女贞子滋补肝脾肾，涩精固脱；茯苓补气健脾，泽泻利湿泄浊，牡丹皮活血化瘀，溪黄草、白茅根、蝉蜕清热解毒，共为佐使，全方共奏益肾固精、化瘀清利之功。本研究结果显示，以加味芪黄饮治疗DN模型大鼠，发现其能降低DN大鼠的24hUAlb、Scr、BUN水平，减轻肾组织病理损伤，且随剂量增加疗效更趋显著。这与课题组前期的临床研究结果具有一致性[4,5,6]。

胰岛素抵抗（IR）是指多种原因导致胰岛素靶器官对胰岛素敏感性降低，机体需代偿性分泌过多胰岛素以维持血糖稳定的病理状态[10,11]。本研究结果显示，加味芪黄饮可降低DN大鼠FBG及FINS水平，提高ISI，改善DN大鼠的IR状态。IR在DN的发生发展中起重要作用，大量研究表明，改善IR可延缓DN进展。Zhao等[12]采用石斛制剂治疗DN大鼠，发现其可通过降低大鼠FIns水平，改善IR状态，最终减轻大鼠肾组织病理损伤。Qin等[13]采用前列地尔联合羟苯磺酸钙辅助治疗DN患者，发现其可通过改善IR状态，使患者Scr、BUN水平降低，改善DN症状。

胰岛素受体底物-1(IRS-1）是胰岛素信号通路中重要的信号蛋白，一般情况下，胰岛素到达靶组织后，首先与靶组织上的胰岛素受体结合，继而通过经典信号通路胰岛素受体底物-1/磷脂酰肌醇-3激酶/葡萄糖转运体4(IRS-1/PI3K/GLUT4），促进细胞对葡萄糖的摄取和利用[14]。研究表明，IRS-1表达上调可改善DN的IR状态。Gao等[15]研究显示，在DN小鼠模型中，IRS-1表达升高可改善小鼠IR状态，进而减轻DN小鼠的肾损伤。Liu等[16]采用丹红注射液治疗DN小鼠，发现其可通过上调IRS-1表达，改善小鼠IR状态，从而降低小鼠的蛋白尿水平。本研究结果也显示，与模型对照组相比，加味芪黄饮高、低剂量组大鼠肾组织IRS-1表达增加，且其升高程度与加味芪黄饮剂量呈正相关。这提示加味芪黄饮可能通过IRS-1发挥作用。

综上所述，加味芪黄饮能保护DN的肾功能，减轻DN大鼠肾组织损伤，其可能通过上调IRS-1表达，以改善胰岛素抵抗状态而发挥作用。

参考文献：

[4]饶家珍,唐瑾秋,刘晓璇,等.加味芪黄饮对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质成纤维连接蛋白(FN)及p12MAPK信号通路的影响[J].黑龙江中医药,2013,42(2):56-59.

[5]于晓瑜,蒙向欣,赵威.加味芪黄饮治疗早期糖尿病肾病临床研究[J].黑龙江中医药,2014,43(2):30-31.

[6]李娟.加味芪黄饮对治疗早期糖尿病肾病胰岛素抵抗的影响观察[J].糖尿病新世界,2016,19(24):37-38.

[9]吕娟,张蕊,曹兰秀,等.养生益肾汤联合厄贝沙坦治疗早期糖尿病肾病临床研究[J].国际中医中药杂志,2018,40(11):1033-1036.

赵威,蒙向欣,李辉远.加味芪黄饮对糖尿病肾病的作用及其机制研究[J].中药新药与临床药理,2020,31(08):930-933.