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大鼠湿热型溃疡性结肠炎采用中药治疗的疗效观察

2020-08-03 209 上传者：管理员

摘要：[目的]研究中药对大鼠湿热型溃疡性结肠炎(UC)的治疗效果。[方法]将80只SPF级雄性wistar大鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、西药组(C组)、中药组(D组),每组20只。A组正常饲养,B、C、D组建立大鼠湿热证UC模型,建模成功第2天,B组大鼠以生理盐水灌胃,C组以美沙拉嗪灌胃治疗,D组以化湿疏郁方灌胃治疗,给药疗程7d。观察指标包括症状学、结肠黏膜及病理组织学。[结果]造模后,与A组相比,B、C、D组大鼠均出现摄食量、摄水量、活动性减低及血便,B组疾病活动指数(DAI)评分明显升高(P<0.05),大体形态损伤指数(CMDI)评分明显升高(P<0.05);治疗7d后,与B组相比,C组、D组大鼠摄食量、摄水量、活动性明显增加,DAI评分明显降低(P<0.05);且治疗7d后,与B组相比,C组、D组大鼠结肠黏膜出血、溃疡,充血、水肿现象明显减轻,CMDI评分显著降低(P<0.05);C组、D组大鼠结肠黏膜病理观察细胞排列结构比较整齐、少量杯状细胞消失及淋巴细胞和中性粒细胞浸润。[结论]大鼠湿热证UC模型制备成功,化湿疏郁方可改善UC大鼠一般情况,增高湿热型UC模型大鼠黏膜愈合率(肉眼+病理学),治疗湿热型UC疗效肯定。

关键词：
中药
治疗
溃疡性结肠炎
药学
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溃疡性结肠炎是一种主要累及结直肠的慢性非特异性炎症性疾病,其病因及发病机制尚不完全明确,主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液便和血便[1]。在中医中属于“久痢”范畴[2]。因其病因尚不明确,缺乏有效的治疗方法,目前临床上的主要治疗药物包括氨基水杨酸制剂、激素、免疫抑制剂等,治疗周期长且极易复发,严重影响患者的生活质量,被WHO确定为现代难治病[3]。本课题组以改良2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠法联合环境饮食复合法制备的湿热证UC大鼠模型为研究对象[4],研究中药化湿疏郁方对大鼠湿热证型UC的治疗效果,以期为临床治疗UC提供新的思路。

1、材料与方法

1.1材料

实验动物为SPF级雄性wistar大鼠,6～8周龄,体重250～280g(中国医学科学院医学实验动物研究所提供)。

1.2主要仪器与试剂

人工气候箱(广东省医疗器械厂)、麻醉机(北京益仁恒业科技有限公司)、大鼠灌胃针(北京健力园医疗器械有限公司)、无水乙醇(北京化学试剂公司),TNBS、液体石蜡及1mL注射液由南开医院消化科提供。

1.3方法

1.3.1动物分组及湿热型UC模型制备

80只雄性wistar大鼠,恒温(25℃左右)饲养,光照和黑暗各12h交替,自由进食标准颗粒饲料及饮水,适应环境7d,随机分为4个组,每组20只,即A组(对照组)、B组(模型组)、C组(西药组)、D组(中药组)。

采用改良TNBS/乙醇溶液灌肠法联合环境饮食复合法。自然环境,A组正常饲养,B、C、D组高糖高脂饲料喂养10d,第11天将大鼠置于人工气候箱(温度35℃,相对湿度85%),每天持续8h,连续3d后,第14天采用改良TNBS/乙醇溶液灌肠法制备大鼠湿热型UC模型。

1.3.2药物制备及给药

中西药剂量根据《新药研究与方法》。化湿疏郁法药物组成为:白头翁30g、黄柏10g、黄连8g、秦皮12g、炒白芍30g、炙甘草30g、生地榆15g、煨木香10g、肉桂6g、乌梅15g、郁金18g、柴胡15g、香附10g。

中药炮制方法:委托我院中药制作研究基地以层析法分别提取单药有效成分,加工浓缩均制成5mL糊剂,并对pH值、浓度、卫生学等进行检测。实验大鼠西药给药剂量:美沙拉嗪84mg/d,混合研碎配成5mL溶液,配好的中西药均置于4℃冰箱保存,使用前摇匀。给药方法:C组:灌食西药2.5mL/次,2次/d;D组:灌食中药2.5mL/次,2次/d。

A组正常饲养,不做任何处理。B组造模成功后第2天予生理盐水灌胃,2.5mL/次,2次/d;C组术后第2天起予西药美沙拉嗪灌胃治疗;D组术后第2天起予中药化湿疏郁方灌胃治疗,给药疗程为7d。

1.3.3观测指标及方法

化湿疏郁法对大鼠UC治疗疗效评价包括:症状学、结肠黏膜及病理组织学。症状学:包括精神、活动、饮食、毛发光泽度、大便性状等,同时按疾病活动指数(DAI)标准统计分析。总分之和,≤2分为症状缓解;3～5分为轻度活动;6～10分为中度活动;11～12分为重度活动。见表1。

表1DAI评分表

黏膜形态学:标准参照大体形态损伤指数进行黏膜评分(表2)。动物禁食不禁水24h后称重,麻醉、仰卧固定,采血后处死动物,打开腹腔,游离大肠,沿肠系膜对侧剪开,生理盐水灌洗,开水烫过的毛笔刷去肠腔内容物,并将结肠平铺于超薄泡沫上,大头针固定后,肉眼观察并评分。

表2结肠黏膜肉眼观察评分标准

病理组织学:参照Gaudio结肠病理评分标准(表3)。取其远端结肠(距肛门0.5cm)约1.0cm×0.5cm,10%甲醛固定,常规石蜡包埋,病理切片(苏木精-伊红染色),显微镜下观察黏膜病理变化。每个组织块选取3张染色切片,每张切片随机选取3个视野,用OlymPusBX60显微镜观察。

1.4统计学方法

数据采用x±s表示。采用SPSS11.5统计软件处理数据,其中组内计量资料采用T检验或单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各实验组大鼠的一般状态

A组大鼠被毛紧密贴身,色白光泽,两眼有神,活动敏捷,食量较多,大便呈颗粒状;B、C、D组大鼠造模后均有不同程度的行动迟缓、精神减弱、对外界刺激淡漠、被毛松散、毛色光泽减弱、饮水量及食量下降,便血,体重下降等。A、B、C、D组的DAI评分分别为:0、3.19±0.54、2.57±0.57、2.52±0.32。B组DAI评分与A组相比显著增高(P<0.05)。经治疗7d后,与B组相比,C组、D组上述症状较前明显好转,DAI评分明显降低(P<0.05)。说明UC造模成功,西药美沙拉嗪及中药化湿疏郁方均对湿热型UC大鼠具有治疗作用。

2.2各组大鼠结肠黏膜标本及CMDI积分比较

A组大鼠结肠黏膜未见充血、水肿、出血及溃疡形成等情况;造模后B组大鼠结肠黏膜可见明显的充血、水肿、出血及溃疡形成。A、B、C、D组的CMDI分别为:0、3.38±0.63、2.59±0.42、2.47±0.62。相比与A组相比,B组CMDI评分显著增高(P<0.05);经治疗7d后,肉眼观察大鼠结肠黏膜充血、水肿、出血及溃疡等现象明显减轻;C组及D组CMDI评分与B组比较显著降低(P<0.05)。

表3Gaudio结肠病理评分标准

2.3各实验组大鼠结肠黏膜病理组织学观察及积分

显微镜下观察大鼠结肠黏膜病理组织切片,可见A组大鼠结肠黏膜细胞排列整齐,无中性粒细胞及淋巴细胞浸润,无杯状细胞减少等现象;B组大鼠结肠黏膜细胞排列紊乱,有中性粒细胞及淋巴细胞浸润及杯状细胞消失等现象。A、B、C、D组的结肠黏膜病理组织学积分为:0、20.15±1.22、16.41±1.63、15.41±1.58;与A组相比,B组计分显著升高(P<0.05);经治疗7d后,C组及D组大鼠结肠黏膜细胞排列较为整齐,有少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润,杯状细胞消失,与B组相比,病理组织学计分显著降低(P<0.05,图1)。

图1大鼠结肠黏膜组织切片苏木精-伊红染色

3、讨论

UC属于慢性炎症反应性疾病,其临床表现主要包括腹痛、腹泻、黏液脓血便等,因其发病机制至今不明,缺乏有效的治疗药物。5-氨基水杨酸作为治疗UC的一线药物,治疗效果不甚理想,因此UC患者常出现病情迁延不愈、复发、加重等情况,最终不得不手术切除结肠,给UC患者造成了极大的心身伤害[5]。近些年,UC的发病率逐年上升,迫切需要能对UC进行有效治疗的药物。

UC在中医学中属于“久痢”的范畴,大肠湿热证是其常见类型,UC患者以腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便等为主要表现,并且于结肠黏膜可见出血及溃疡形成[6]。从中医学角度上来讲,盖因气血流通受阻,不通则痛;肠络受邪,津液输布失常,湿邪蕴结肠络,泄泻频作;湿热熏蒸、气机阻滞则里急后重;痰浊瘀毒阻塞脉道,日久化热,热盛肉腐,血不循经,则便可见黏液脓血;肠络受邪,络脉气血运行不畅、气血壅塞、日久蕴结湿热,形成瘀毒,腐溃黏膜及脉道[7,8]。

以化湿疏郁法治疗“久痢”古已有之,其代表方剂为白头翁汤。《伤寒论·辨厥阴病脉证并治》中曾记述:“热利下重者,白头翁汤主之。下利欲饮水者,以有热故也,白头翁汤主之”[9]。本课题中所用化湿疏郁方便是由白头翁汤加减而得。其主要成分为:白头翁30g、黄柏10g、黄连8g、秦皮12g、炒白芍30g、炙甘草30g、生地榆15g、煨木香10g、肉桂6g、乌梅15g、郁金18g、柴胡15g、香附10g。方中白头翁苦寒能入阳明血分,清热解毒,凉血止痢为君药;秦皮苦寒性涩,能凉肝益肾而固下焦;黄连凉心清肝,黄柏泻火补水,并能燥湿止痢而厚肠,取寒能胜热,苦能坚肾,涩能断下,故黄连、黄柏、秦皮可清热燥湿、泻火解毒为臣药;炒白芍养血和营、缓急止痛;郁金体清气窜,其气先上行而微下达,长于行气解郁、祛瘀止痛;煨木香行气导滞,“调气则后重自除”;生地榆止血收敛,配乌梅加强收敛止泻,共为佐药;肉桂其辛热温通之性,配在苦寒药中是为“反佐”能防止苦寒伤阳,冰伏湿热之邪;柴胡香附疏肝解郁、理气和胃,甘草补脾益气,清热解毒,和中调药,与芍药相配,又能缓急止痛,亦为佐使。诸药合用,湿去热清,气血调和,故下痢可愈[10,11]。

我们的前期实验研究发现,改良TNBS/乙醇复合造模法,继承了传统方法的优点,克服了传统方法实践中遇到的不足,造模后的成功率及模型稳定性都得到提高,所以本实验仍采用该方法进行UC动物模型制备,造模后发现小鼠DAI值明显升高,结肠黏膜出现明显的充血、水肿及溃疡形成,显微镜下可见细胞排列紊乱,炎症细胞浸润、杯状细胞缺失,溃疡形成,造模成功。湿热型模型采用高脂高糖饮食造成湿热体质后,利用TNBS/乙醇复合法灌肠,可以构建出较为理想的湿热型UC模型。本实验采用常规方法进行湿热证造模方法,高糖高脂饮食,高温高湿环境,模型小鼠在湿热造模期间可出现醉酒表现、少食、体重下降、黏液脓血便、肛周湿热红肿,符合湿热证模型。

本课题组前期临床实践证实中医清热化湿法治疗UC最常见证型大肠湿热证安全有效,可修复结肠黏膜,改善患者腹部症状及大便性状,患者全身症状明显改善,生活质量提高。其后进行的动物实验研究证实:化湿疏郁方对治疗大鼠湿热型UC具有很好的疗效,可明显改善湿热型UC大鼠的一般状态,促进大鼠损伤结肠黏膜的修复,有效抑制炎性细胞的浸润。且通过实验证明,其治疗效果明显,这对于临床上以中医治疗UC提供了很好的思路。化湿疏郁方治疗大鼠湿热型UC的具体机制有待进一步研究。中医化湿疏郁方对UC的治疗可能通过降低免疫及炎症指标,修复免疫屏障而发挥作用的[12]。今后在细胞信号传导通路及蛋白组学差异蛋白等方面应深入研究,为中医清热化湿疏郁治疗UC提供科学依据。

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