目前实验用乳铁蛋白(LF)多来源于人或是牛乳中存在的一种能与铁离子可逆性结合的非血红素蛋白,主要分泌于乳腺上皮细胞,具有非常广泛且显著的生物学与医学应用价值。另外,对正常细胞的生长繁殖以及凝血也有一定的调节作用[1]。乳铁蛋白通过介导乳铁蛋白与病毒识别受体硫酸乙酰肝素的结合,从而阻断病毒的入侵与繁殖。凝胶剂作为一种全新的载药系统已经被广泛应用于临床治疗当中。由于其与人体的黏膜组织有很好的黏附性,有利于药物在病灶局部发挥药效[2]。因此针对女性人乳头瘤病毒(HPV)感染,采用凝胶剂型阴道给药方式达到治疗疾病的目的。本文根据乳铁蛋白及凝胶剂的优越性,选择合适的凝胶基质制备乳铁蛋白凝胶剂,并对其质量进行考察。

1、仪器与材料

1.1仪器

UV-1600紫外-可见光分光光度仪(北京瑞科分析仪器公司);BSA224S分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司);BJ-6六连磁力搅拌器(上海巴玖实力有限公司);PHS-3C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司);SB-1100型恒温水浴锅(上海爱郎仪器有限公司);具塞离心试管(上海满贤经贸有限公司);NDJ-1型旋转式黏度计(上海昌吉地质仪器有限公司);0516-1型台式低速离心机(上海医疗器械有限公司)。

1.2材料

1.2.1药品

乳铁蛋白(低温喷雾干燥,华中海威北京基因科技有限公司);壳聚糖(脱乙酰度90%,青岛海伽生物科技有限公司);明胶(郑州星耀科技有限公司);尼泊金乙酯;甘油(天津富宇化工精细有限公司);氯化钠(天津德恩化学试剂有限公司);硫酸铜(河南辉腾化工产品销售有限公司);酒石酸钾钠;碘化钾;氢氧化钠(徐州索通生物科技有限公司);泊洛沙姆407(巴斯夫中国有限公司);海藻酸钠(巴斯夫中国有限公司);各培养基均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2.2试验对象

成熟家兔(雌性,体重1.8～2.5kg)由河南省医学动物实验中心提供,动物购入后适应环境一周。

2、试验方法

2.1乳铁蛋白凝胶剂的处方筛选

2.1.1以泊洛沙姆407为凝胶基质

称取0.03g尼泊金乙酯加水至60g,70℃水浴条件下搅拌至完全溶解,放置至室温,加入25g泊洛沙姆407,冰水浴条件下搅拌至完全溶解[3],取12.5g甘油加入其中,搅拌均匀,置于37℃水浴下形成凝胶,取出放置至室温;取乳铁蛋白3g溶于20g水中,加入到上述凝胶基质中,加水至100g,混匀。

2.1.2以壳聚糖、海藻酸钠为凝胶基质

称取尼泊金乙酯0.03g于50g水中,60℃水浴下恒温搅拌至完全溶解,取出放置至室温,加入3.2g海藻酸钠,密封放置过夜使其充分溶胀,在溶胀好的海藻酸钠溶液中加入12.5g甘油,搅拌均匀;另称取壳聚糖1.0g,加10mL水搅拌溶解,迅速倒入海藻酸钠溶液中混合,加入0.3g碳酸钙搅拌均匀[4,5]。取乳铁蛋白3.0g溶于10.0g水中加入上述基质,加水至100g,混匀。

2.1.3以壳聚糖、甘油-明胶为凝胶基质

称取明胶1.2g于盛有60g水的烧杯中,浸泡30min,加入12.5g甘油,0.03g尼泊金乙酯,70℃下搅拌至完全溶解,加入3.0g壳聚糖,搅拌至完全溶解,加水至80g,放置至温度30℃左右;另取乳铁蛋白3.0g于盛有15g水的小烧杯中,搅拌至完全溶解后加水至20g,搅拌均匀;将乳铁蛋白溶液加入到上述凝胶基质中,混匀。

2.2乳铁蛋白凝胶剂的质量考察

2.2.1pH值的测定

取待测凝胶剂1.0g,加入10mL37℃的水,搅拌均匀,放置至室温,用PHS-3C型精密酸度仪测其pH值。

2.2.2黏度测定

取待测凝胶剂约150g于250mL烧杯中,用NDJ-1型旋转式黏度计在37℃下反复测试。

2.2.3微生物限度检查

1)需氧菌、霉菌(酵母菌)的检查。

供试液的制备:取制剂1.0g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100mL,混匀震荡使溶解作为供试液。薄膜过滤后,用100mLpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜,再过滤后将滤膜菌面朝上贴于培养基上。需氧菌培养温度35℃,培养3d;霉菌培养温度25℃,培养5d。每组做两个平行样。

2)金黄色葡萄球菌检查。

取制剂1.0g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100mL,混匀震荡使溶解作为供试液。薄膜过滤后用100mLpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜,再过滤后将滤膜加入15mL胰酪大豆胨液体培养基中35℃培养20h。

取上述培养物,接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上,35℃培养48h。同法,取1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌薄膜过滤后,做阳性对照,阴性对照不加任何溶液。每组做两个平行样。

3)铜绿假单胞菌检查。

取样品1.0g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100mL,混匀震荡使溶解作为供试液。薄膜过滤后用100mLpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜,再过滤后将滤膜加入15mL胰酪大豆胨液体培养基中35℃培养20h。

取上述培养物,划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上35℃培养48h。同法,取1mL不大于100cfu的铜绿假单胞菌薄膜过滤后,做阳性对照。阴性对照不加任何溶液。每组做两个平行样。

取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验:将洁净滤纸片置于平面皿内,用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上,滴加新配制的质量分数为1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液,在30s内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。

4)白色念珠菌。

取样品1.0g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100mL,混匀震荡使溶解作为供试液。薄膜过滤后用100mLpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜,再过滤后将滤膜加入15mL沙氏葡萄糖液体培养基中35℃培养4d。

取上述培养物,划线于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,35℃培养36h。同法,取1mL不大于100cfu的白色念珠菌薄膜过滤后,做阳性对照。阴性对照不加任何溶液,每组做两个平行样。

2.2.4含量测定

1)双缩脲试剂的制备。

取硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.15g、酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)0.60g和碘化钾0.50g,加水50mL使其溶解,边搅拌边加入质量分数为10%的氢氧化钠溶液30mL,用水稀释至100mL,混匀,即得。

2)标准蛋白质溶液的制备。

称取定量血清白蛋白标准品加水溶解,配制成浓度为10mg·mL-1的蛋白溶液。

3)供试品溶液的制备。

精密量取适量的供试品,加水搅拌溶解稀释制成浓度为10mg·mL-1的蛋白溶液。

4)标准曲线的描绘。

分别精密量取2)所配制的标准蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于5mL具塞试管中,编号为1～5,将各试管加水至1.0mL,分别加双缩脲试剂4.0mL,立即振摇混匀。另取一试管加水1.0mL,加双缩脲试剂4.0mL,振摇混匀做空白对照,编号为0。将0～5号具塞试管室温放置30min充分反应显色。按照紫外-可见光分光光度法,在540nm波长处测定各浓度下对应的吸光度。同时,做标准蛋白质溶液吸光度与其对应溶液浓度的回归曲线图,并求取其直线回归方程。

5)供试品蛋白质含量测定。

精密量取3)中所配的供试品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于具塞试管中,编号分别为1～5,将各试管加水至1.0mL,之后加1)中所配制的双缩脲试剂4.0mL,立即振摇混匀。按4)中空白对照的做法做空白对照,编号0。将该组6支试管全部置于37℃水浴中30min反应显色,将溶液离心,放置至室温后取上清液同法测定各浓度下供试品溶液的吸光度,将数值代入标准曲线回归方程中即得各供试品溶液蛋白质浓度,将测得的吸光度值代入回归方程中计算即可算得供试品溶液中蛋白质含量。

2.3安全性评价

按照2.1项下所筛选出的方法制备受试所用的乳铁蛋白凝胶剂,乳铁蛋白的含量为每100g含3.0g,临床用量为每天一次,一次3g,按成年女性体重50kg计,则给药量为60mg·kg-1,本试验选择受试动物为家兔,给药剂量为0.5g·kg-1,相当于临床用药剂量的8.3倍[6]。随机将20只雌性家兔分为4组,每组5只,分别编为A、B、C、D组。A组为生理盐水组,B组为空白凝胶剂组(即不加乳铁蛋白溶液,以同质量的水代替),C组为含有三倍乳铁蛋白剂量组,相当于临床给药的25倍,D组为五倍乳铁蛋白剂量组,相当于临床给药的41.7倍[7,8]。将试验动物以适当体位固定结实,暴露会阴和阴道口部位。将连接有钝头软塞的注射器吸入定量的受试液后缓慢地插入动物阴道4～5cm处,并轻轻推注相应的受试制剂。给药后使家兔在特制铁丝笼内呈仰卧位10min后放回,连续给药8d。每天观察并记录阴道口症状(如充血、水肿及分泌物等)[9]。在末次给药后的24h内将受试动物处死,解剖,肉眼观察并记录阴道充血和炎症情况[10,11]。

3、实验结果

3.1处方筛选结果

对以三种基质所制得的凝胶进行澄明度、均一性以及制剂的连续性检验,结果对比,见表1。

表1三种基质所制得的凝胶对比

通过以上实验结果可看出,以壳聚糖和甘油-明胶为基质所制得的凝胶均匀细腻,且该基质廉价易得,制备工艺简单,较适合实际化生产。以此处方制备乳铁蛋白凝胶剂并进行相关质量考察。

3.2乳铁蛋白凝胶剂的质量考察结果

反复测试该制剂的pH值在4.0～6.0之间,黏度在200～300mPa·s-1,微生物检测结果,见表2。

表2需氧菌、霉菌检测结果

依据评判标准,本制剂未检测出金黄色葡萄球菌;铜绿假单胞菌;白色含珠菌。

3.3乳铁蛋白含量测定结果

乳铁蛋白溶液吸光度值,见表3。

表3标准蛋白质溶液吸光度值

经拟合所得标准曲线回归方程为:

Y=0.2145X+0.108(R2=0.99988)。

供试品溶液吸光度值,见表4。

表4供试品溶液吸光度值

将所测得的供试品蛋白质溶液吸光度代入回归直线方程可得各浓度溶液中蛋白质的浓度,结果见表5。

表5供试品蛋白质浓度计算结果

由于供试品溶液为梯度浓度,需对供试品蛋白质溶液进行还原求其含量,其计算公式如下:

蛋白质含量=测得蛋白质溶度*稀释倍数

未经稀释的标准蛋白质溶液含量为30mg·mL-1。经计算,成品制剂中乳铁蛋白的含量在标示量的90%～110%之间。因此,该制剂实验室生产过程中能保证其主药含量的可控性。制剂的pH符合给药部位对pH的要求,且黏度适宜,微生物限度检测结果符合《中国药典》2015版对非无菌制剂微生物限度的要求。综合以上检测结果可看出,该制剂有较高的生产实用性,可为乳铁蛋白应用于抗HPV病毒在实际生产方面的研究提供依据。

3.4安全性评价试验记录及结果

3.4.1受试家兔体重测定结果

实验前对各受试家兔进行体重测定,其结果见表6。

表6受试家兔体重(kg)

在给药期间,各组家兔均无死亡及异常情况发生,给药量达临床的25倍及41.7倍时,家兔仍无异常情况发生。

3.4.2受试家兔进食量及掉毛情况

从整个阴道给药试验来看,在给药期间,第8天有个别家兔分泌少许血状分泌物,其他各组家兔无异常分泌物排出,且阴道口无明显红肿糜烂等不良现象。给药结束后处死家兔取出阴道解剖观察,阴道内壁无明显红肿坏死等过敏现象,且用药剂量达临床用药的25、41.7倍时,各相应的受试家兔阴道均无明显不良反应,说明该药物相对安全,有望成为抗HPV病毒的新药物。

从整体上看,整个给药过程中,各组家兔均无死亡情况,用药剂量提升至临床给药的41.7倍时,家兔无异常状况,表明该药物的安全性较高。在给药的前两天,家兔的进食量明显减少,考虑因试验要求在给药前后需禁水4h,可导致进食量减少,此种现象属动物正常生理反应;从给药的第3天起,家兔的进食量明显恢复,与0d相比无明显差异,说明给药量对家兔进食量无显著影响。家兔掉毛情况无显著区别,由此试验可说明药物的安全性较高。

4、讨论

高危HPV感染大大增加患者患宫颈癌的概率,临床研究发现[12]除应用干扰素治疗外,联合局部药物治疗疗效更好。目前市面上的妇科疾病用的凝胶剂常气味难闻或作用时间短,影响了患者使用的依从性,有学者针对阴道内弱碱性环境等特点,研制稳定性更好,有芳香味的凝胶剂[13]。

本实验制备了乳铁蛋白凝胶剂,考察其相应的质量指标及安全性,为其应用于抗HPV病毒研究奠定基础。以凝胶剂的外观、稳定性及蛋白络合情况为指标,筛选出最佳的凝胶基质并确定制备工艺;以《中国药典》2015版的相关检测方法为依据,测定该制剂的pH、黏度、微生物限度及蛋白质含量;制作乳铁蛋白含量不同的凝胶剂,以家兔为试验动物,观察给药部位的表观变化及存活情况,评价制剂的安全性。结果表明,以壳聚糖、甘油-明胶为凝胶基质所制的凝胶均匀细腻且不发生蛋白络合;测得的制剂pH为4.0～5.0,黏度为200～300mPa·s-1,微生物限度符合要求,含量测得值与实际加入量基本一致;整个安全性试验过程中家兔无死亡情况,给药部位无明显过敏、出血等不良现象。该制剂的基质廉价易得,制备工艺简单,质量可控,安全性高。

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