咽喉反流(laryngopharyngeal reflux, LPR)是指胃内容物因各种原因反流至咽喉部位，并对该部位黏膜造成损伤而引发的一系列症状及体征总称。LPR患者主要有咽部异物感、慢性咳嗽、痰多或鼻涕倒流、持续清嗓及反酸、烧心等症状，少数患者有呼吸不畅或喉痉挛等症状，其在喉镜下主要有杓间区或环后区水肿、喉室变浅及假声带沟等表现[1]。据文献报道，LPR与诸多上呼吸道疾病发病相关，如慢性喉炎[2]、慢性咳嗽[3]、哮喘、变应性鼻炎[4]、慢性鼻窦炎[5]及儿童分泌性中耳炎[6]、腺样体肥大[7]等。在耳鼻喉科门诊中，约10%的咽喉疾病患者和约50%的慢性声嘶患者被诊断为LPR[8],因此LPR是近年来被耳鼻喉科医生普遍认识并高度重视的疾病之一[9]。

LPR的主要黏膜刺激物之一是胃蛋白酶，它通过消化蛋白质损害上呼吸道细胞功能，引起喉部、鼻咽和鼻腔的炎症变化。胃蛋白酶原是胃主细胞分泌的一种肽酶，在酸性条件下(pH=2～6.5)被激活为胃蛋白酶[5]。当胃蛋白酶与其他胃内容物反流至胃以外的部位时，胃蛋白酶通过水解消化细胞间连接(主要是缝隙连接),损害上皮屏障[10],破坏其接触部位黏膜，引起LPR相关症状及体征。这些症状及体征的评估目前主要依赖于反流症状指数量表(reflux symptom index, RSI)与反流体征指数量表(reflux finding score, RFS)[11,12],存在一定的主观性和经验偏倚。目前，唾液胃蛋白酶检测方法无创、成本低且客观性强，可弥补RSI、RFS量表及24 h pH监测等方法的不足，但国内外学者对于唾液胃蛋白酶检测的应用价值仍存在较大争议。本研究通过对LPR患者给予质子泵抑制剂(proton pump inhibitor, PPI)治疗，并比较治疗前后RSI及RFS量表评分和唾液胃蛋白酶浓度变化，探讨PPI治疗对LPR患者唾液胃蛋白酶浓度的影响，从侧面分析唾液胃蛋白酶检测在LPR中的应用价值。

1、资料与方法

1.1临床资料

以2019年8月—2020年12月我院耳鼻咽喉头颈外科收治的以咽部异物感、咽干、痰多等非特异性症状为主诉的152例疑似LPR初诊患者为研究对象。纳入标准：入组患者于研究开始前2周内停止服用所有与治疗消化道疾病相关药物；不伴有肺、肝、肾等全身重要脏器疾病；无其他上呼吸道感染疾病(如上呼吸道感染、肺结核和急、慢性扁桃体炎等)。排除标准：孕期和哺乳期妇女；其他正在接受会影响本研究的治疗患者；既往被诊断过LPR并曾接受PPI治疗的患者。本研究经我院伦理委员会审查批准，参与研究患者均已签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1 RSI与RFS量表评估

所有入组患者均需完成RSI量表评分和电子喉镜检查。参照RSI量表，安排2名专科医生协助患者进行评分(0～5分，共6个等级；0分为无症状，5分为非常严重)。RSI量表内容包括声嘶或发声障碍，持续清嗓，痰多或鼻涕倒流，吞咽食物、水或药片不利，饭后或躺下后咳嗽，呼吸不畅或反复窒息发作，烦人的咳嗽，咽部异物感及烧心、胸痛、胃痛等9项指标，各指标评分相加总分超过13分定义为RSI(+)。对患者行电子喉镜检查，由2名高年资主治医师参照RFS量表对患者喉镜表现进行独立评分。RFS量表内容包括假声带沟、喉室消失、红斑或充血、声带水肿、弥漫性喉水肿、后连合增生、肉芽肿及喉内黏稠黏液附着等8项指标，各指标评分相加超过7分定义为RFS(+)。RSI>13分或RFS>7分患者纳入LPR(+)组，其余患者纳入LPR(-)组；RSI>13分患者纳入RSI(+)组，RSI≤13分患者纳入RSI(-)组；RFS>7分患者纳入RFS(+)组，RFS≤7分患者纳入RFS(-)组。

1.2.2 PPI治疗

经RSI与RFS量表评估确定为LPR(+)的患者，给予PPI(泮托拉唑钠肠溶片)口服治疗，20 mg/次，2次/d,于早、晚餐进食前半小时温水吞服。持续用药4周后复查电子喉镜，并再次进行RSI与RFS量表评分。

1.2.3唾液标本收集

指导患者入组期间多餐少食，避免精神刺激，戒咖啡、烟酒，晚睡前不进食，睡眠时选择合适枕头高度。采集患者初诊及复查当天空腹唾液，嘱患者咳嗽清嗓，从喉部咳出至少1 mL唾液，并储存至1.5 mL唾液样本采集管中，使用高速低温冷冻离心机于2～8℃离心15 min,转速1000×g,获得上清液，分装后储存于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.4唾液胃蛋白酶浓度检测

使用胃蛋白酶酶联免疫吸附试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)检测唾液中胃蛋白酶浓度，具体操作步骤为：将解冻后的唾液上清液原液稀释10倍后按50μL/孔依次滴加入待测样品孔，标准品按照浓度200 ng/mL、66.67 ng/mL、22.22 ng/mL、7.41 ng/mL、2.47 ng/mL、0 ng/mL加入标准孔，待测样品孔与标准孔中均预先包被有胃蛋白酶单克隆抗体，然后依次加入检测溶液A工作液50μL、检测溶液B工作液100μL,底物溶液90μL,终止溶液50μL,使用酶标仪在450 nm波长测量各孔的OD值，计算样品浓度。具体计算方法如下：利用Excel软件作图，标准品浓度的对数作为Y值，标准品OD值作为X值，拟合一元二次方程(Y=-0.3203X2-1.245X+4.5218);将检测样品的OD值作为X值带入公式中，得到Y值，作以10为底的指数运算得到检测样品浓度值。由于本研究中检测样品是样本原液稀释10倍得到，因此计算得到的检测样品浓度需乘以稀释倍数，得到样本原液浓度。

1.3统计学分析

运用SPSS 22.0对数据进行统计分析，计量资料符合正态分布时用x¯±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；如不符合正态分布则采用M(P25,P75)表示，组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。LPR患者PPI治疗前后的RSI、RFS量表评分及唾液胃蛋白酶浓度比较，若符合正态性采用配对t检验；不符合正态性采用配对Wilcoxon符号秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 LPR(+)组与LPR(-)组患者临床基线资料分析

152例疑似LPR患者中，男49例，女103例，年龄(46.11±13.56)岁，其中LPR(+)组112例，LPR(-)组40例。LPR(+)组中，男42例，女70例，年龄18～76岁，平均(46.89±13.24)岁，BMI (23.29±2.78 )kg/m2,唾液收集时平均空腹时间(10.46±5.79) h; LPR(-)组中，男7例，女33例，年龄19～72岁，平均(43.90±14.35)岁，BMI (22.38±3.32) kg/m2,唾液收集时平均空腹时间(11.35±4.83) h。LPR(+)组与LPR(-)组在年龄、BMI、空腹时间等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

2.2 LPR(+)组与LPR(-)组患者唾液胃蛋白酶浓度比较

LPR(+)组患者唾液胃蛋白酶浓度显著高于LPR(-)组(73.01 ng/mL vs 25.66 ng/mL,P<0.01),而RFS(+)组患者唾液胃蛋白酶浓度亦显著高于RFS(-)组(78.00 ng/mL vs 35.79 ng/mL,P<0.01),但RSI(+)组患者唾液胃蛋白酶浓度与RSI(-)组比较，差异无统计学意义(48.15 ng/mL vs 55.24 ng/mL,P>0.05),见表1。

表1 LPR(+)组与LPR(-)组患者唾液胃蛋白酶浓度比较

RFS(-)组   62     35.79(19.68,61.14)          

2.3 LPR患者应用PPI治疗前后RSI、RFS量表评分及唾液胃蛋白酶浓度变化

LPR患者应用PPI治疗1个月后的RSI评分(P<0.05)、RFS评分(P<0.01)均显著降低，唾液胃蛋白酶浓度显著低于治疗前(P<0.05)。具体来说，RSI量表内咽部异物感(P<0.01)及烧心、胸痛、胃痛(P<0.05)等症状评分在治疗后显著降低，且RFS量表内假声带沟(P<0.01)、红斑或充血(P<0.05)、声带水肿(P<0.01)、后连合增生(P<0.01)及喉内黏稠黏液附着(P<0.01)等体征评分在治疗后亦显著降低，而喉室消失、声带肉芽肿等体征评分在治疗前后差异无统计学意义(P>0.05),见表2。声带水肿评分的降低幅度显著高于后连合增生(P<0.05)。

表2 LPR患者应用PPI治疗前后RSI、RFS量表评分及唾液胃蛋白酶浓度变化

3、讨论

胃蛋白酶作为咽喉反流的重要分子，其检测结果是否可作为LPR的诊断依据一直是耳鼻喉科医生关注的热点。2017年Calvo-Henriquez等[13]提出唾液胃蛋白酶检测也许可作为一种可靠的LPR诊断分子，Wang等[14]对截止2017年3月的唾液胃蛋白酶与LPR的研究进行荟萃分析，发现唾液胃蛋白酶诊断LPR的敏感性与特异性分别为64%和68%,曲线下面积(AUC)为0.71,唾液胃蛋白酶对LPR的诊断价值中等。与上述观点相悖，Bozzani等[2]研究发现LPR组患者和健康对照组之间唾液胃蛋白酶阳性率并无显著差异，甚至对照组的胃蛋白酶浓度值高于LPR组患者。因此，关于LPR患者唾液胃蛋白酶的研究存在较大争议。本研究发现，以RSI>13分或RFS>7分为标准将入组患者分为LPR(+)组与LPR(-)组，LPR(+)组唾液胃蛋白酶浓度显著高于LPR(-)组，且RFS(+)组唾液胃蛋白酶浓度亦显著高于RFS(-)组，但RSI(+)组与RSI(-)组唾液胃蛋白酶浓度并无显著性差异，这可能是因为RSI量表评分基于患者主观评价，某些患者在评价自己主观症状时夹杂严重心理负担，因而夸大了某些症状，也可能是由于LPR的症状特异性不强，仅凭症状判断是否患有LPR,误诊及漏诊率会大大提高，而临床医生具有多年工作经验，通过评价喉镜检查结果得到的RFS量表评分可能比RSI量表评分临床意义更大、更客观。因此，唾液胃蛋白酶浓度也许可作为反映LPR疾病情况的一个有效指标。

但是，国内外学者对于唾液胃蛋白酶检测的应用价值存在较大争议。Yadlapati等[15]研究发现LPR患者唾液胃蛋白酶浓度显著高于健康对照组，而Jung等[16]虽在41例LPR患者唾液中检测到胃蛋白酶，但其平均浓度仅有(17.15±20.42) ng/mL,在其中9例患者唾液中未检测到胃蛋白酶，说明唾液中胃蛋白酶浓度可能存在较大个体和地域差异。Bobin等[17]应用多通道腔内阻抗-pH监测检测65例LPR患者的反流情况，发现在反流发作30 min内及数小时后的唾液胃蛋白酶平均浓度分别为(92.0±108.1) ng/mL和(101.8±131.0) ng/mL,而Zhang等[18]以双pH探头24 h下咽-食管多通道腔内阻抗检测作为金标准诊断LPR,并使用75 ng/mL作为病理性胃蛋白酶浓度阈值，分析结果发现唾液胃蛋白酶检测诊断LPR的特异性为75.0%,敏感性为57.7%。LPR患者唾液胃蛋白酶浓度阳性检测值的不同可能是由于人种、地域及检测时间、检测方法的异质性导致，这种现象亦与Calvo-Henriquez等[13]的研究结果相符。

LPR的主要病理生理学机制是胃液对上呼吸道和消化道黏膜的直接刺激。胃液主要由盐酸、胃蛋白酶等成分组成，胆汁酸、胆汁盐以及胃肠道中的细菌等亦是胃液的组成成分。根据胃液的酸碱度，咽喉反流内容物可以分为以下三类：酸性反流(pH<4),反流内容物主要由盐酸组成；弱酸性反流(pH=4～7),反流内容物包括盐酸、胃蛋白酶和胆汁酸等在内多种混合成分；弱碱性反流(pH>7),反流内容物主要由胃蛋白酶和胆汁酸组成。有研究表明，单独的胃酸不能破坏黏膜上皮屏障的完整性，但胃蛋白酶和胃酸同时存在会对喉部黏膜造成严重损害[19],突出说明了胃蛋白酶在咽喉部黏膜损伤中的重要作用。本研究采用PPI治疗LPR,抑酸治疗显效者可能多为酸性或弱酸性反流，其反流内容物主要为盐酸、胃蛋白酶与胆汁酸，这可能也是LPR患者应用PPI治疗后唾液胃蛋白酶浓度下降的重要原因之一。

胃蛋白酶在低pH环境(pH=2～3)中可达到最高活性[20]。因此，连续的反流发作，特别是酸反流，可激活位于喉部的胃蛋白酶原。但是，在pH值为6～7时也可观察到部分胃蛋白酶活性，说明混合性反流或微碱性反流也可能激活胃蛋白酶原[5]。咽喉部pH平均值为6.8,发生反流后pH值会相应下降，反流至咽喉部的胃蛋白酶原与H+接触后可被激活为有活性的胃蛋白酶，并经由受体介导的胞吞作用进入咽喉部黏膜上皮细胞，通过直接分解细胞膜蛋白及胞内蛋白(如E-钙黏蛋白[21]、Sep53[22]),或被高尔基体吞噬后间接分解高尔基体、线粒体及溶酶体等细胞器途径参与LPR的病理损伤[19]。碳酸酐酶在胃蛋白酶损伤咽喉部黏膜过程中起到一定保护作用，健康人咽喉部黏膜可表达少量碳酸酐酶同工酶Ⅲ(CAⅢ),通过催化二氧化碳的可逆水合作用(即生成碳酸氢根离子)调节咽喉部pH值，促进局部环境的碱化，间接降低胃蛋白酶活性[23],这也是生理性反流发生后胃内容物不会造成咽喉部临床症状的重要原因。但LPR患者的异常反流导致碳酸酐酶的保护性调节作用耗竭[24],胃内容物中的胃蛋白酶原经反流到达咽喉部位，而咽喉部无法产生足够的碳酸盐来中和H+,胃蛋白酶原被H+激活为胃蛋白酶，继而胃蛋白酶与H+共同作用导致咽喉部黏膜损伤。上呼吸道上皮的另一个保护屏障涉及鳞状上皮应激蛋白(Sep70蛋白),胃蛋白酶可通过影响CAⅢ和Sep70的功能，导致上呼吸道黏膜上皮细胞功能受损[22]。

胃蛋白酶除通过上述途径参与LPR病理损伤外，还可影响氧化应激和炎症反应相关基因表达，增加氧化应激和活性氧的积累，亦可通过受体途径与炎性细胞因子及线粒体相互作用，破坏线粒体DNA[25],导致慢性暴露于胃蛋白酶的喉黏膜和邻近组织出现相应炎症改变，在喉镜下表现为黏膜红斑(尤其是杓会厌皱襞)、假声带沟、喉内黏液潴留、声带水肿、后连合增生、声带肉芽肿及喉室消失等体征[20]。因此，本研究中PPI治疗可能通过显著减少LPR患者唾液胃蛋白酶浓度，促进患者咽部异物感及烧心、胸痛、胃痛等症状及假声带沟、红斑或充血、声带水肿、后连合增生及喉内黏膜黏液附着等体征评分显著降低。由于胃蛋白酶原被激活后可分解损伤黏膜上皮细胞，而胃蛋白酶在弱酸性环境中常与胆汁酸共同反流，且LPR患者由胃到食管再到咽喉均可被反流内容物累及，因此LPR患者治疗前的烧心、胸痛、胃痛症状较治疗后更严重。此外，Bulmer等[26]采用猪的咽喉反流损伤模型量化了胃酸和胃蛋白酶对咽喉组织的损害，发现声带及声门下黏膜为柱状上皮，对酸暴露更为敏感，其受到酸及胃蛋白酶刺激后CAⅢ表达明显降低，而后连合和室带黏膜为鳞状上皮，受损后CAⅢ表达明显升高，抗反流损伤作用增强，因此声带比后连合更易发生反流相关炎症损伤，这与我们前述结果一致，即LPR患者经过PPI治疗后，声带水肿评分的降低幅度显著高于后连合增生。

本研究不足之处在于，由于未纳入健康对照人群，我们无法确定因生理性反流导致的唾液胃蛋白酶基线水平；其次，对于唾液标本的收集时间，本研究未确定某一个或几个特定时间点，而是仅记录了患者留取唾液标本时距上一次进餐或饮水的空腹时间，仍有待进一步改进。

综上所述，LPR患者应用PPI治疗1个月后部分症状及体征评分和唾液胃蛋白酶浓度均显著下降，提示胃蛋白酶在LPR发病过程中发挥重要作用，且胃蛋白酶可能与咽部异物感及声带水肿等症状体征密切相关。

参考文献：

[1]黄俣栋,谭嘉杰,韩晓燕,等儿童腺样体肥大与咽喉反流的相关性研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2018,32(12):899- 904.

文章来源：张青青,谢萌,郭瑞昕,马思敬,刘小红,杨敏娟,李娜,刘海琴,任晓勇,罗花南.质子泵抑制剂对咽喉反流患者唾液胃蛋白酶浓度的影响[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2021,35(11):965-970.