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一种新型量子点胶束的制备及其在细胞成像中的应用

2020-08-13 484 上传者：管理员

摘要：目的：对水热法合成的硅量子点进行疏水化修饰,制备一种基于量子点的胶束,并探讨其在细胞成像中的应用。方法：以抗坏血酸和3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷为原料,采用水热法合成硅量子点(SiQD),用十八烷基三甲氧基硅烷对SiQD表面进行疏水化修饰获得O-SiQD,将其与DSPE-PEG2000自组装得到在水中能稳定分散的胶束粒子(QDM),用透射电子显微镜(TEM)、丁达尔效应和动态光散射(DLS)等对其性能进行表征;应用CCK-8试剂盒检测QDM的细胞毒性;利用高内涵细胞成像系统评价QDM的细胞成像性能。结果：TEM结果显示SiQD的粒径为(3.64±0.11)nm;DLS表明QDM分布均匀,水合粒径为(86.79±1.18)nm,表面电势约为(-11.65±0.64)mV;QDM(<100μg•mL-1)无明显细胞毒性;QDM与A549细胞孵育6h后,在细胞胞浆内能检测到较好的量子点荧光信号。结论：O-SiQD的合成方法简单高效,安全剂量的QDM具有较好的胞内成像功能。

关键词：
生物成像
硅量子点
胶束
药剂学
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硅量子点作为一种新型的纳米材料,具有独特的光学性质,生物相容性良好,其在光电子设备、微量检测和生物成像等方面得到较广泛的应用[1,2,3]。然而,大部分硅量子点在水溶液中分散性差,易聚集和沉降,而且发光性能容易受生物环境中其他分子的干扰,阻碍了其在细胞成像中的应用[4]。研究表明,硅量子点表面进行疏水化修饰后,可制备成量子点胶束。量子点胶束能较好地保护量子点性能,且具有在水溶液中分散性及稳定性较好、生物相容性高等优势,在细胞成像和动物成像中有一定的应用前景[5,6,7]。将量子点进行疏水化修饰是制备量子点胶束的前提,然而,目前对量子点进行疏水化修饰方法要求量子点表面具有Si-H或Si-Cl/Br基团[8,9,10],该要求大大限制了对量子点胶束种类的探索和应用。

抗坏血酸又称维生素C,低毒且容易获取,其为一种多羟基化合物,具有较强的还原性,是一种理想的制备量子点的原料[2,11,12]。本研究以抗坏血酸为原料,首次与3-(2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基)丙基-三甲氧基硅烷通过水热法合成了一种硅量子点,并进一步与十八烷基硅烷偶联制备成疏水性硅量子点(简称为O-SiQD),制备过程如图1A所示。同时,将该疏水量子点与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(简称为DSPE-PEG2000)自组装,制备成水合粒径为(86.79±1.18)nm的胶束(简称为QDM),制备过程如图1B所示。

1、材料

1.1仪器

透射电子显微镜(TEM,美国TitanG260-300);冷冻干燥机(中国SCIENTZ-18N);X射线光电子能谱仪(美国ThermoESCALAB250XI);荧光分光光度计(F-7000,日本HITACHI);傅里叶变换红外光谱分析仪(英国PerkinElmerL1600300SpectrumTwoLita);紫外可见分光计(中国PERSEETU-1901);马尔文激光粒度仪(ZetasizerNanoZS,英国MalvernInstruments);高内涵成像系统。

1.2试药

抗坏血酸(纯度:95%,湖南汇虹试剂);3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷(纯度:95%,上海麦克林生化科技有限公司);十八烷基三甲氧基硅烷(纯度:90%,上海罗恩试剂);DSPE-PEG2000(纯度:95%,上海源叶生物科技有限公司)。

1.3细胞

腺癌人类肺泡基底上皮细胞A549细胞系购自中科院上海细胞库。

2、方法

2.1SiQD的合成与表征

称取0.084g抗坏血酸溶于3mL超纯水中,搅拌溶解,加入0.3mL3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷,50℃水浴下反应6h;反应完毕,将反应液加入到10mL四氢呋喃中,析出固体,离心,沉降物即为SiQD。

TEM观察其形态及粒径;X射线光电子能谱仪检测SiQD的光电子能谱(XPS);采用紫外可见分光计测定SiQD的紫外-可见光谱图(UV-Vis);采用荧光分光光度计测量SiQD的荧光光谱图;采用傅里叶变换红外光谱分析仪测定SiQD红外光谱图(FTIR)。

2.2O-SiQD及QDM的合成与表征

2.2.1O-SiQD的合成与表征

取“2.1”项下反应完毕后的反应液,加入12mL无水乙醇和0.9mL十八烷基三甲氧基硅烷,反应至沉淀析出,沉淀物即为脂肪链修饰的疏水性硅量子点(O-SiQD)。采用傅里叶变换红外光谱分析仪测定O-SiQD红外光谱图。

2.2.2QDM的制备与表征

使用薄膜水化法制备QDM[13]:称取1.5mgO-SiQD和5mgDSPC-PEG2000溶解于0.7mL氯仿中,旋蒸成膜后,加入3mL超纯水,55℃水浴30min,超声后使用0.22μm过滤器过滤得QDM溶液,经冻干得胶束粉末。通过TEM和马尔文激光粒度仪对QDM的粒径进行表征。

2.3QDM的细胞毒性研究及其细胞成像

取对数生长期的A549细胞,以5000个/孔的浓度接种于96孔板中,于5%CO2、37℃培养箱中孵育24h,加入用无血清培养基稀释的25、50、100和200μg·mL-1QDM溶液,培养箱中孵育24h,使用CCK-8测试剂盒检测细胞活性。用无血清培养基配制100μg·mL-1QDM溶液与A549细胞在培养箱中孵育6h,吸弃培养基,用生理盐水清洗细胞2次,加入生理盐水,使用高内涵进行细胞荧光成像。

3、结果与讨论

3.1SiQD的合成及表征

本研究采用水热合成法制备SiQD[14,15],通过TEM观察到其为圆形纳米粒子且分布均匀(见图2A),粒径为(3.64±0.11)nm的粒子(见图2B)。在紫外光下,SiQD在水溶液中呈蓝光,随着激发波长增大,发射光强度减弱,且只有微弱的红移出现(见图3A)。紫外-可见吸收光谱显示,SiQD的最大吸收波长是324nm(见图3B)。X射线光电子能谱仪检测SiQD的XPS(见图3C)显示SiQD表面含有Si、C、O、N等元素;其中C和O元素占主要,说明抗坏血酸在量子点中起到了重要的骨架作用。红外吸收光谱图(见图4B)显示,量子点基团主要有-OH(3435cm-1)、-NH2(1634cm-1)、Si-OH(1040cm-1)和Si-O-Si(1118cm-1)。结果表明通过水热法可以简单有效合成粒径较为均一的硅量子点,而Si-O-Si键的形成说明偶联剂在量子点形成过程中起着重要的连接作用,是量子点形成的基础[16]。

3.2O-SiQD及QDM的合成与表征

利用十八烷基三甲氧基硅烷对SiQD表面进行疏水化修饰,制备疏水性硅量子点O-SiQD。由图4A可知,SiQD经修饰后,由原来的亲水性转变为疏水性,可以溶于氯仿中。对比SiQD与O-SiQD的红外吸收光谱图(见图4B),O-SiQD在2920cm-1和1468cm-1处有明显CH不饱和拉伸振动和CH弯曲振动。结果表明十八烷基三甲氧基硅烷可以与SiQD表面的基团,如-OH、-NH和Si-OH,进一步偶联,成功在SiQD表面修饰上脂肪链[17]。

图1O-SiQD(A)合成及QDM(B)制备示意图

O-SiQD与DSPC-PEG2000通过薄膜水化法自组装形成了QDM,当使用激光光束照射时,能观察到明显的丁达尔效应,且保留着发光性能(见图5A),QDM的TEM图显示其接近球形(见图5B),水合粒径为(86.79±1.18)nm(见图5C),表面电势为(-11.65±0.64)mV(见图5D)。结果表明,O-SiQD可以与DSPC-PEG2000有效组装成具有发光特性,分散性良好的胶束。

CCK-8结果表明QDM在浓度为25、50及100μg·mL-1对A549细胞无明显毒性,200μg·mL-1对细胞的活性的抑制率为(26.23±2.23)%(见图6A)。研究证实高浓度DSPE-PEG2000可能具有一定的细胞毒性[5]。前期预实验已证实,与200μg·mL-1QDM同等投量的DSPE-PEG2000具有一定的细胞毒性(数据未显示),因此推测:200μg·mL-1QDM的细胞毒性可能来自高浓度DSPE-PEG2000的细胞毒性。将含100μg·mL-1QDM的无血清培养基与A549细胞共孵育6h后吸除培养基,使用PBS清洗两遍后可检测到QDM在细胞胞浆内的荧光信号(见图6B),提示所制备的QDM在安全浓度范围内可用于细胞成像。

4、结论

本研究以硅源和抗坏血酸为原料通过水热法合成了硅量子点SiQD,TEM、UV-vis、FTIR等结果表明SiQD成功合成。随后,将SiQD与十八烷基三甲氧基硅烷偶合制备成疏水性量子点O-SiQD。从O-SiQD可溶于氯仿的现象及FTIR结果上判断SiQD疏水化修饰成功。本研究为水热合成的硅量子点进行疏水化修饰提供了一种简易有效的方法。此外,本研究还通过薄膜水化法,将O-SiQD进一步与DSPC-PEG2000组装成量子点胶束QDM。细胞实验证明QDM在浓度低于100μg·mL-1时无明显毒性,且能有效实现细胞内成像。与传统胶束相比,量子点胶束具有更好的稳定性[18,19,20],而本研究丰富了量子点胶束的类型,所制备量子点胶束有望在生物成像和药物递送方面获得应用。

参考文献：

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江仁庭,任欢欢,竺敏,胡敦,周高雅,柴志勇,王珊.一种新型量子点胶束的制备及其细胞成像研究[J].中南药学,2020,18(07):1094-1098.

基金:中南大学研究生科研创新项目(No.2018zzts381);2019年湖南省技术创新引导计划项目(No.2018SK50608);2019年湖南省技术创新引导计划项目(No.2018sk50602).