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制备载夫西地酸钠壳聚糖纳米粒及评价其体外抑菌活性

2020-08-13 263 上传者：管理员

摘要：目的：制备夫西地酸钠载药壳聚糖纳米粒(Fus-loadedCNs),并评价其体外抗菌活性。方法：以壳聚糖用量(X1)、三聚磷酸钠用量(X2)、探头超声时间(X3)作为考察因素,以纳米粒粒径分布(Y1)和药物包封率(Y2)作为评价指标,通过Box-Behnken响应面法优化得到Fus-loadedCNs最优处方和工艺参数,并考察了Fus-loadedCNs的理化性质以及体外药物释放情况。通过抑菌圈实验比较了Fus原料药与Fus-loadedCNs对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性。结果：经实验优化得到Fus-loadedCNs的最优处方和工艺参数为:壳聚糖用量为90mg,三聚磷酸钠(sodiumtripolyphosphate,TPP)用量为33mg,探头超声时间为3min,制备的Fus-loadedCNs在透射电镜下可观察到外观圆整,分布均匀,粒径大小为(161.4±9.3)nm,Zeta电位为(14.2±0.9)mV,Fus-loadedCNs体外释放速率表现为先快后慢趋势;Fus-loadedCNs对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性要高于Fus原料药。结论：将夫西地酸钠制备成壳聚糖纳米粒,不仅可以降低药物释放速率,减少用药次数,而且提高了药物的抗菌活性,有望成为夫西地酸钠的新型给药形式用于临床治疗。

关键词：
Box-Behnken响应面法
壳聚糖纳米粒
夫西地酸钠
抗菌活性
药剂学
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夫西地酸钠是20世纪60年代由丹麦LeoLaboratories公司开发的一种具有甾体骨架结构的抗生素,其作用机制是通过抑制细菌蛋白质合成而产生杀菌作用,对革兰氏阳性球菌具有强大的抗菌作用[1,2],临床上用于治疗因革兰氏阳性球菌(如:金黄葡萄球菌、链球菌、肠球菌等)引起的皮肤及软组织感染,商品名为“立思丁”。然而,由于夫西地酸钠的渗透性较差,在局部外用吸收仅有2%[3],严重影响了药物的治疗效果。壳聚糖属于一种多聚阳离子高分子化合物,具有良好的生物相容性,生物降解性和保湿性,已在新型药物给药系统中得到广泛研究与应用[4,5],其表面氨基基团发生质子化后带有正电荷,能够与细菌表面带负电荷的基团相互作用,改变细胞膜的流动性和通透性,具有抑菌效果[6,7]。文献[8,9,10]报道采用离子凝胶化法将抗菌药物包载到壳聚糖中制备成壳聚糖载药纳米粒,可以提高抗菌药物的抑菌活性。本文作者将夫西地酸钠制备成载药壳聚糖纳米粒,并通过体外抑菌圈实验评价抗菌活性,为夫西地酸钠的局部外用提供一种新的用药思路。

1、仪器与材料

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂),HX-600US智能超声波细胞破碎仪(北京祥郝科技发展有限公司),ZRS-8LD智能药物溶出仪(上海书培实验设备有限公司),HT7700型透射电子显微镜(日本Hitachi公司),RIGOLL-3000高效液相色谱系统(苏州普源精电科技有限公司),ZetasizerNanoZSE纳米粒度仪(英国Malvin公司),GL-25MS超速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司),纤维素透析袋(截留相对分子质量:10000,南京森贝伽生物科技有限公司)。

夫西地酸钠(四川海思科制药有限公司,批号:20171204,含量质量分数:99.3%),壳聚糖(脱乙酰度:95%,相对分子质量:5.0×104,广州齐云生物技术有限公司),三聚磷酸钠(sodiumtripolyphosphate,TPP,天津市博迪化工有限公司),冰醋酸(天津市博迪化工有限公司)。

2、方法与结果

2.1制备fus-loadedCNs

通过前期制备工艺筛选,本文作者最终确定采用离子凝胶法[11,12]制备Fus-loadedCNs。称取一定量壳聚糖溶解到pH为5.5的醋酸溶液中,形成壳聚糖溶液;称取处方量Fus原料药溶解到壳聚糖溶液中;在4000r·min-1磁力搅拌下,使用带7号针头注射器将一定量TPP加入到上述溶液中,持续搅拌20min,得到外观呈淡黄色乳浊液,使用超声波细胞破碎仪超声处理一定时间,既得到Fus-loadedCNs。

2.2粒径测定

使用ZetasizerNanoZSE纳米粒度仪测定Fus-loadedCNs粒径分布。设置测定散射角为173°,测试温度为25℃。取新制备的Fus-loadedCNs加入蒸馏水稀释至10倍,测定粒径分布。

2.3包封率测定

使用低温超速离心法测定Fus-loadedCNs的包封率。取新制备的Fus-loadedCNs溶液4mL加入到离心管中,在15000r·min-1离心速度下离心60min,使用移液管移取1mL上层澄清液加入到25mL量瓶中,加入流动相定容,作为未包封药物测定液(Wfree);另取Fus-loadedCNs溶液1mL加入到100mL量瓶中,加入少量乙腈溶解破坏Fus-loadedCNs,再加入流动相定容,作为总药物测定液(Wtotal);依次取2种测定溶液过0.45μm微孔滤头,取续滤液进样测定Fus含量[13]。每份样品重复测试3次,取平均值。包封率计算公式:包封率=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%。

2.4Box-Behnken响应面法优化Fus-loadedCNs

基于预实验结果,选择影响Fus-loadedCNs关键性质的3个因素:壳聚糖用量(X1,mg)、TPP用量(X2,mg)和探头超声时间(X3,min)作为考察因素,以纳米粒粒径分布(Y1,nm)和药物包封率(Y2,%)作为评价指标,通过Box-Behnken响应面法优化得到Fus-loadedCNs最优处方和工艺参数。3个因素水平设定值见表1,实验设计生成17组实验,按照实验设计进行实验,实验结果见表2。

表1Box-Behnken响应面法各因素水平值

方差分析结果显示(结果见表3),Y1、Y2拟合方程P值分别为<0.0001和0.0005,均小于0.05,说明拟合方程显著;Y1、Y2拟合方程的失拟项P值分别为0.3341和0.5374,均大于0.05,说明拟合方程预测性可靠。X1,X2,X3,X21,X22,X23对Y1影响较为显著,X1,X2,X1X2,X21,X22,X23对Y2影响较为显著,通过响应面图(图1)可进一步分析3个因素之间的交互作用对Y1和Y2的影响。

在超声时间恒定时,粒径大小随着壳聚糖用量的增加而增大,这可能是由于随着壳聚糖用量的增加,分散介质的黏度增加,减弱了超声作用,导致粒径分布增大;随着TPP用量的增加粒径增大,这是由于壳聚糖中的酰胺键随着TPP的磷酸根离子的增加结合数量增多,TPP与壳聚糖之间形成的共价键刚性增加,减弱了超声作用,导致粒径增大;在壳聚糖用量恒定时,增加超声处理时间可以降低粒径分布,这是由于超声时间延长,超声波对壳聚糖纳米粒的做功增大,有利于粒径减小。3个因素与粒径分布(Y1)之间的二次多项式拟合方程为:Y1=151.98+47.39X1+19.98X2-16.04X3-7.50X1X2-5.07X1X3+8.10X2X3+19.22X21+26.85X22+26.42X23(R2=0.9892)。

表2实验设计及结果

表3方差分析结果

图1壳聚糖用量(X1)、TPP用量(X2)和探头超声时间(X3)对粒径分布(Y1)的效应面图

在超声时间恒定时,包封率随着壳聚糖用量的增加而增大,这可能是由于较高的壳聚糖用量可以与TPP发生更多的交联化,增加了包裹药物分子的能力;随着TPP用量的增加,包封率增大,同样是由于壳聚糖酰胺键与TPP交联化增加,同样提高了包裹药物分子的能力。超声时间对药物包封率不显著。3个因素与包封率(Y2)之间的二次多项式拟合方程为:Y2=88.36+6.16X1+7.66X2-0.90X3+5.55X1X2-0.67X1X3-1.28X2X3-7.98X21-10.28X22-4.05X23(R2=0.9584)(图2)。

图2壳聚糖用量(X1)、TPP用量(X2)和探头超声时间(X3)对包封率(Y2)的效应面图

本研究中,作者要求制备的Fus-loadedCNs粒径分布应为“最小值”,粒径越小,越有利于Fus-loadedCNs吸附到细菌表面,增加抑菌效果,包封率应为“最大值”,以达到最大载药量,在实验软件中设置可接受粒径大小的上限为180nm,包封率的下限为85%,基于模型预测得到Fus-loadedCNs的最优处方和工艺参数为:壳聚糖用量为90mg,TPP用量为33mg,探头超声时间为3min,模型预测Fus-loadedCNs粒径大小为155.6nm,包封率为89.3%。为了验证模型预测的准确性,按照最优处方和制备工艺连续制备3批Fus-loadedCNs,测定其粒径分布和包封率,比较实验观测值与预测值之间的差异性。结果显示,Fus-loadedCNs的粒径分布和包封率的实验观测值与模型预测值之间差异在±5%以内,模型预测可靠性较高(图3)。

2.5Fus-loadedCNs性质测定

2.5.1粒度分布和Zeta电位测定

用移液枪取300μLFus-loadedCNs溶液至石英比色杯中,加入3.0mL蒸馏水,轻轻振摇混匀。设置测定散射角为173°,环境温度为25℃,使用ZetasizerNanoZSE纳米粒度仪测定Fus-loadedCNs粒径分布,每份样品测定3次,取平均值。由测定结果可知(图4),Fus-loadedCNs平均粒径为(161.4±9.3)nm,Zeta电位为(14.2±0.9)mV。

图3Fus-loadedCNs的处方工艺叠加图

2.5.2透镜下形态

取少量经稀释的Fus-loadedCNs溶液,滴加到镀碳涂覆膜的铜网表面,滴加质量分数为2%的磷钨酸染色,用滤纸吸去多于水分,阴凉处干燥,通过透射电镜观察Fus-loadedCNs的表面结构,并拍摄照片。在透射电镜下可以观察到Fus-loadedCNs外观圆整,分布均匀,未发现有药物沉淀(图5)。

2.6体外释放评价

采用动态透析法[14]评价Fus-loadedCNs体外释药情况。取Fus-loadedCNs和夫西地酸钠注射液各2mL(夫西地酸钠含量均为20g·L-1),分别加入到预先处理好的纤维素透析袋(截留相对分子质量为10000)中,系紧两端。在2只烧杯中分别加入pH7.4磷酸盐缓冲液250mL,水浴加热至(37±0.5)℃,保持恒温,同时磁力搅拌速度设置为100r·min-1。将装有2种溶液的透析袋放入到烧杯中,分别在l、2、3、4、6、8、10、12、24和48h取介质溶液(补加同温同体积空白介质)5mL,过滤,续滤液经稀释后测定药物含量[13],计算累积释放度,绘制释放曲线(图6)。

图4Fus-loadedCNs粒径分布和Zeta电位

图5Fus-loadedCNs透射电镜照片

图6Fus-loadedCNs和Fus注射液体外释药曲线(n=6)

药物释放曲线显示,Fus注射液中药物在3h内基本释放完全,而Fus-loadedCNs中药物释放比较缓慢,且表现为双相释药模式,即在释药前期(释药前6h)药物快速释放,这部分药物主要是来自未包封在壳聚糖纳米粒中的药物以及吸附在其表面的药物;在后期药物释放变为缓慢,这主要是壳聚糖纳米粒发生降解后,释放了包裹在其内部的药物。根据Fus-loadedCNs在体外释药模式可以推测在用药部位也会出现类似药物释放现象,这样前期快速释药有利于药物迅速达到抑菌浓度,在后期药物可以维持稳定抑菌浓度,能够有效达到抑菌效果。

2.7抑菌圈实验

参照文献[15]采用抑菌圈实验评价Fus-loadedCNs对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果。取浓度为5×108CFU·L-1金黄色葡萄球菌混悬液100μL与细菌培养基熔融后平铺到表面中,待冷却凝固后在培养基上取4个小孔,分别将蒸馏水(blank)、空白壳聚糖纳米粒(CNs)、夫西地酸钠原料药(Fus)和Fus-loadedCNs加入到小孔内(Fus原料药和Fus-loadedCNs中含相同量药物),放到培养箱中培养24h,测定抑菌圈直径(图7)。

图7空白壳聚糖纳米粒、Fus原料药、Fus-loadedCNs对金黄色葡萄球菌形成的抑菌圈

抑菌圈实验结果显示,空白壳聚糖纳米粒具有微弱的抑菌效果,而Fus原料药和Fus-loadedCNs抑菌效果较为明显,且Fus-loadedCNs的抑菌圈直径要大于Fus溶液组,说明Fus-loadedCNs对金黄色葡萄球菌的抑菌活性要高于Fus溶液。

3、讨论与结论

本研究中,作者采用壳聚糖作为纳米载体材料,采用壳聚糖表面的氨基与夫西地酸钠中的羧基形成共价键,并通过离子凝胶法将夫西地酸钠制备成壳聚糖纳米粒,并通过抑菌圈实验证明其抑菌效果要高于其原料药。一个方面,由于壳聚糖纳米粒粒径较小,具有较大的比表面积,能够有效提高药物对细胞膜的渗透性;另一方面,Fus-loadedCNs表面带有正电荷,当其与细菌接触后,能够牢牢吸附到表面带有负电荷的细菌细胞膜上,然后迅速释放药物,药物达到有效抑菌浓度后缓慢释放,维持较长时间的抑菌活性。本研究中,作者制备的Fus-loadedCNs在局部外用预防伤口及软组织感染方面具有较大的应用价值,它能够有效的延长药物在感染处的抑菌浓度,提高抗菌活性。本研究结果可为夫西地酸钠外用预防与治疗伤口及软组织感染提供一种新的用药途径。

本研究中,作者计划以泊洛沙姆407作为载体,将Fus-loadedCNs进一步制备成凝胶剂,因为泊洛沙姆407溶液具有温度敏感性,在体温下可转变成凝胶,黏附到皮肤表面,溶胶-凝胶的转变过程不存在化学反应,通过外界温度变化即可自行发生,另外原位凝胶存在的亲水性和多孔性有利于伤口处于湿润环境,能够水化组织,有利于伤口愈合。

于佳,李桂茹.载夫西地酸钠壳聚糖纳米粒的制备与体外抑菌活性[J].沈阳药科大学学报,2020,37(07):585-591.