阿戈美拉汀是全球首个靶向褪黑激素受体激动剂类抗抑郁药,起效较快、不良反应少、安全性高,是抑郁症治疗领域的一个新突破[1]。市售制剂为法国Servier公司开发的阿戈美拉汀片剂,口服生物利用度极低(<5%)[2],且抑郁症属于神经系统障碍类疾病,需要长期服药,将其开发成肌肉注射的长效制剂,能延长作用时间,增强疗效并提高患者的顺应性。

聚乳酸和聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA)是已被美国FDA批准的可安全用于药物传递系统的聚酯类材料,以其良好的生物相容性和生物可降解性被广泛应用在缓控释注射给药系统[3]。结合阿戈美拉汀自身性质及注射用缓控释制剂的优势,本文作者以PLA为载体,制备肌肉注射的阿戈美拉汀混悬型长效注射剂并考察其体外特性。

1、仪器与材料

日立L-2000高效液相色谱仪(日本Hitachi公司),ZWF-110X30恒温水浴振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司),电子分析天平(德国Sartorius公司),PF-101T集热式恒温磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂),Minizeta湿法循环研磨机(德国Netzsch仪器制造有限公司),BT-9300S激光粒度测定仪(丹东百特仪器有限公司),雷磁ZDY-502常量水分滴定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

阿戈美拉汀原料药(辽宁本源制药有限公司),聚乳酸(D,L-PLA,m=5、10、20kDa),聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA75/25,PLGA50/50,m=10kDa)(济南岱罡生物工程有限公司),F68(德国BASF公司),海藻糖(南宁中诺生物工程有限责任公司),二氯甲烷、甲醇、乙腈等(天津康科德化学试剂有限公司)。

2、方法与结果

2.1含量测定方法的建立

2.1.1色谱条件

Phenomenex色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-水(体积比为70:30),检测波长:230nm,流速:1.0mL·min-1,柱温:25℃,进样量:20μL[4]。

2.1.2含量测定方法

精密称取阿戈美拉汀长效注射剂(约相当于阿戈美拉汀2mg)于100mL量瓶中,加入适量乙腈超声溶解并稀释至刻度,混匀,0.22μm微孔滤膜过滤后测定药物含量。

2.1.3体外释放度测定方法

本实验的释放介质为含0.2g·L-1NaN3的5g·L-1SDS的磷酸盐缓冲液(pH=7.4,10mmol·L-1)。精密称取阿戈美拉汀长效制剂(含阿戈美拉汀约7mg)于透析袋中,加入1mL释放介质,分散均匀,置于含有49mL释放介质的具塞试管中,样品放入37℃恒温水浴振荡器中,以转速为100r·min-1振荡。定时取样,再加入1mL新鲜的释放介质,继续放入37℃恒温水浴振荡器中。将取出的样品用0.22μm滤膜过滤,用HPLC法测定阿戈美拉汀的含量并计算累积释放度。

2.2阿戈美拉汀长效注射剂的制备

2.2.1溶剂蒸发法制备聚合物微粒

称取处方量的阿戈美拉汀和载体(PLA/PLGA)置于50mL圆底烧瓶中,加入5mL的二氯甲烷溶解,28℃减压蒸馏除去大部分有机溶剂,再在40℃条件下真空干燥24h直至溶剂全部去除,粉碎,过孔径为150μm的筛网,得到阿戈美拉汀聚合物微粒(agomelatineloadedmicroparticles,AMP)。

2.2.2湿法研磨制备阿戈美拉汀长效注射剂

将250mg原料药或者2.5g上述产物在持续搅拌条件下分散在250mL含有10g·L-1的F68稳定剂的水溶液中,使分散完全,将一定量氧化锆研磨珠(直径为2mm)置于研磨机腔体,倒入药物分散液,按1500r·min-1转速研磨至所需粒径,取出得到药物微晶混悬液或者阿戈美拉汀聚合物微粒混悬液(AMPs-sus),3000r·min-1离心1min,并用10mL稳定剂水溶液分散,使制剂浓缩至约为25g·L-1。加入50g·L-1的海藻糖作为冻干保护剂,冻干后既得阿戈美拉汀微晶制剂(AGM-lyo)或阿戈美拉汀长效注射剂(AMPs-lyo)。

2.3制剂表征

2.3.1粒径及其分布

本文作者使用BT-9300S激光粒度测定仪,将冻干的微晶制剂和长效注射剂用水重新复溶为混悬液,测定粒径及其分布。如图1所示。

图1粒度测定仪测得的微晶制剂和长效注射剂的粒径频率分布曲线

结果显示,微晶制剂和长效注射剂微粒粒径均约为35μm,但由于长效注射剂制备时溶剂蒸发过程先形成了粒径较均一的初始颗粒,接下来对初始颗粒进行研磨,因此粒径分布比微晶制剂更加均匀。

2.3.2制剂含水量测定

由于聚酯类载体遇水降解,因此含水量对制剂稳定性影响很大,采用用雷磁ZDY-502常量水份测定仪应用卡尔费休法测水分的原理,测定长效注射剂含水量。测定方法为:先用KF试剂预滴定除去滴定杯中溶剂甲醇中存在的少量水分,再用KF试剂滴定已知质量的水分求算滴定度(每mLKF试剂消耗水的质量(mg)),将称量好的样品加入滴定杯中,以自动滴定模式开始滴定,滴定结束后,记录消耗的KF试剂的体积,根据下面公式计算含水量:

W=VKF×m0/(VKF0×m)

式中W为含水量,VKF为样品消耗的卡氏试剂的体积,VKF0为已知质量的水消耗的卡氏试剂的体积,m0为纯水的质量,m为样品的质量。

结果:微晶制剂含水量为0.85%,长效注射剂含水量为0.93%,含水量均满足要求。

2.3.3扫描电镜观察粒子表面形态

通过扫描电镜(scanningelectronmicroscope,SEM)观察原料药,PLA、AGM-lyo和AMPs-lyo的形态和表面特性。方法为:将样品用导电的双面胶固定在铝制短柱上,表面喷金,采用20kV的加速电压扫描其表面并拍照,结果如图2(a-d)所示。

结果显示,阿戈美拉汀原料药呈柱状,粒径在50μm左右(图2a);PLA粒子形状不规则,粒径分布极其不均匀(图2b);AGM-lyo和AMPs-lyo微粒均呈块状,表面粗糙,是研磨过程中研磨珠对粒子的碰撞导致的,且AMPs-lyo比AGM-lyo粒径均匀,这与粒度测定仪测得的结果一致(图2c,2d)。

图2原料药(a),PLA(b),微晶制剂(c),长效注射剂(d)扫描电镜图谱

2.3.4阿戈美拉汀与载体的相互作用

采用傅里叶红外光谱测定阿戈美拉汀与载体PLA间的相互作用,FT-IR测定方法为:取少量样品(约1.0～2.0mg)和100mg的KBr在玛瑙研钵中研磨成均匀的细粉(过孔径为75μm筛网),装入模具内,在10t压力下保持1min压成透明薄片,在波数4000～400cm-1内进行扫描,得到药物、PLA、AGM-PLA物理混合物、长效注射剂的FT-IR光谱,如图3所示。

图3原料药(a)、PLA(b)、物理混合物(c)、聚合物微粒(d)的红外光谱

从图中可以看到,AGM-PLA物理混合物(c)中存在药物分子结构中酰胺键的特征吸收峰:1625cm-1(C=O伸缩振动,酰胺I带)、1548cm-1(NH弯曲振动,酰胺II带)和3505cm-1(N-H伸缩振动),而AMP(d)中N-H伸缩振动峰红移到3501cm-1,推测药物与载体分子之间存在氢键相互作用,这有利于促进药物与载体的相容性,同时增强药物在载体中的分散稳定性[5]。

2.4阿戈美拉汀长效注射剂体外释放度影响因素考察

2.4.1载体种类对药物释放的影响

阿戈美拉汀虽为脂溶性药物,但溶解度略大,依靠药物自身溶解度和肌肉贮库不能很好地控制其释放速率,设计将药物用难溶性载体材料包裹形成微粒,从而减慢药物的释放速率。固定药物与载体质量比例为2∶8,载体分子质量为10kDa,分别以PLGA(质量比为50∶50)、PLGA(质量比为75∶25)和PLA3种聚合物为载体,制得粒径为10μm的长效制剂,按照“2.1.3”的体外释放方法进行实验,考察不同种类的载体对药物释放的影响,如图4所示。

以1d的药物累积释放量表示突释量,当分别使用PLGA(质量比为50∶50)、PLGA(质量比为75∶25)和PLA作为载体时,突释量分别为58.2%、48.5%和45.3%,而无载体的药物微晶制剂的突释高达82.9%,载体的加入对药物释放有明显的阻滞作用,释放速率为PLGA(质量比为50∶50)>PLGA(质量比为75∶25)>D,L-PLA。这一点可由聚合物的水解机制来解释:一方面,富含丙交酯的PLA的亲水性比富含乙交酯的PLGA亲水性低,结晶度高,吸水较少因此降解速率较慢[6];另一方面,溶解度参数理论也可以解释药物的释放行为,根据CRC手册[7]通过集团贡献法计算。AGM的δt为28.12,PLA和PLGA的δt分别为29.97和33.01。AGM和PLA之间的Δδ小于AGM和PLGA之间的Δδ,Δδ越小,两种化合物更易混溶,药物不易溶解并扩散出微粒。因此,与PLGA微粒相比,PLA微粒突释和释放度均较小。因此作者最终选择D,L-PLA作为载体进行后续研究。

图4载体种类对药物从制剂中释放的影响(释放介质为含5g·L-1SDS和0.2g·L-1NaN3的磷酸盐缓冲液,pH7.4,温度为(37±0.5)℃,n=3)

2.4.2载体分子量对药物释放的影响

固定载体为PLA,药物和载体质量比例为2∶8,分别选用分子质量为5、10、20kDa的PLA制得粒径为10μm的长效制剂,进行体外释放实验,单因素考察PLA分子质量对药物释放的影响,释放曲线如图5所示。

当选用不同分子质量的PLA时,突释为20kDa>5kDa>10kDa,释放速率为5kDa>10kDa>20kDa。通常情况下,随着PLGA相对分子质量上升,链长度变长,黏度增加,残留在表面的药物减少,突释降低,因此采用分子质量为5kDa的PLA得到的制剂的突释量和释放速率均大于分子质量为10kDa的;但分子质量为20kDa的突释反而增大,为58.0%。推测为:随着PLGA相对分子质量继续增大,黏度升高,溶解困难,造成药物在载体中分散不均,造成突释增加。综合考虑突释和释放速率,最终确定突释最小且后期释放速率较慢的PLA分子质量为10kDa。

图5载体分子质量对药物从制剂中释放的影响(释放介质为含5g·L-1SDS和0.2g·L-1NaN3的磷酸盐缓冲液,pH7.4,温度为(37±0.5)℃,n=3)

2.4.3药物与载体的比例和制剂粒径对释放的影响

由“2.4.1”和“2.4.2”条可知,选用释放最好的载体药物释放依旧过快,因此考虑降低载药量、增大粒径等手段来降低药物释放速率。固定载体为PLA,分子质量为10kDa,首先采用单因素考察法,设计溶剂蒸发过程中阿戈美拉汀与载体质量比例分别为1∶9和2∶8,制得粒径为10μm的长效制剂,考察药物与载体质量比例对药物释放的影响,结果如图6所示;其次,依旧选用药物与载体质量比例为2∶8,湿法研磨制得粒径分别为10、20、35μm的长效制剂,考察制剂粒径对药物释放的影响,结果如图7所示。

由图6可知,当药物与载体的质量比例由2∶8降为1∶9时,突释明显降低,由45.3%降至18.4%。当药物与载体质量比例为1∶9时,由于前期药物释放量较少,贮库中药物与介质中浓度差较大,后期药物释放速率稍大于药物与载体质量比例为1∶8的制剂;图7显示,随着粒径由10μm提高到35μm,突释和释放度均大幅度减小,突释由45.3%降为19.3%,28d的累积释放量也下降至10%左右。原因为:由于粒径增大,微粒总表面积降低,近表面层的药物量少,因此突释较小;而且药物层层释放,粒径大,内层的药物通过载体水化形成的凝胶层扩散到表面的速率较慢,使得整个释放过程速率较慢。因此降低载药量和增大粒径均能使药物突释显著降低,但是同时考虑到载药量和制剂的通针性等因素,最终确定药物与载体的质量比例为1∶9,不再降低;制剂粒径为35μm,不再增大。

图6药物与载体比例对药物从制剂中释放的影响(释放介质为含5g·L-1SDS和0.2g·L-1NaN3的磷酸盐缓冲液,pH7.4,温度为(37±0.5)℃,n=3)

图7制剂粒径对药物从制剂中释放的影响(释放介质为含5g·L-1SDS和0.2g·L-1NaN3的磷酸盐缓冲液,pH7.4,温度为(37±0.5)℃,n=3)

2.4.4最终处方的体外释放

选用载体为分子质量10kDa的PLA,药物与载体质量比例为1∶9,湿法研磨制得粒径为35μm的长效制剂,以相同粒径的微晶制剂作对照,释放曲线如图8所示。

图8微晶制剂和长效注射剂中药物累积释放曲线

由结果可知,AGM-lyo显示出较高的释放速率,突释为73.5%,并且在2d后药物释放量>98%,基本释放完全。然而,AMPs-lyo释放速率显著降低,突释仅为11.9%,35d累积释放量约为60%,能实现体外1个月以上的缓释效果。

2.5稳定性研究

2.5.1药物在载体中的饱和溶解度的测定

药物与载体形成的是热力学不稳定体系,长期放置过程中可能会析出药物结晶,当载药量低于药物在载体中的饱和溶解度时,药物以分子状态分散在载体中,形成的为固体溶液,属于热力学稳定体系,另一部分以无定型状态存在,属于热力学不稳定体系,因此药物在载体中的溶解度越大,整个体系越稳定。药物部分溶解在载体中后会使其熔融焓减小,参照文献[8]的方法,采用DSC测定药物在载体中的饱和溶解度。制备不同比例系列的药物与载体的物理混合物,使药物的质量分数分别为10%、20%、35%、50%和60%,精密称定,在30～150℃温度内测定DSC并进行回归,即可得到药物在载体中的溶解度,结果如图9所示。

以不同质量分数的熔融焓H对药物的质量分数w作线性回归,回归曲线见图10。

由回归方程可知,当物理混合物中药物的熔融焓为0时,质量分数为2.00%,说明药物在PLA中的溶解度(w)为2.04%。

图9不同质量分数的药物和载体的物理混合物的热分析曲线

图10药物质量分数与熔融焓的关系图

2.5.2药物载体二元体系的Tg测定

将2.5.1中的载药质量分数为10%、20%、35%的3个样品迅速以60℃·min-1冷却,在-10～140℃内进行DSC测定,结果如图11所示。

图11含有不同质量分数的药物的物理混合物的DSC图谱

由结果可知,载药量越高,体系的Tg越低,载药量为10%时,体系的Tg为43℃,当载药量为35%时,Tg已经降到26℃,接近室温,显示在室温下储存就会不稳定。

2.5.3储存稳定性实验

由“2.5.2”条可知,本实验最优处方药物与载体二元体系的Tg为43℃左右,温度超过Tg时PLA会软化,导致粒子聚集,最终制剂的含水量为1%左右,水作为增塑剂又会使Tg略微降低10℃左右[9],结合阿戈美拉汀长效制剂的自身特点,只考察在实际储存条件下的稳定性情况。实验方法为:将含有长效制剂的西林瓶盖紧胶塞,用铝盖封口,置于温度(4±2)℃,湿度(60±10)%的条件下,放置2个月。并于实验第0、5、15天、1个月和2个月取出制剂,以含水量,载药量,粒径和粒径分布为指标进行考察,结果见表1。

表1阿戈美拉汀长效注射剂的稳定性实验结果

结果显示,2个月内载药量和含水量几乎不变,粒径及分布略有增大,但在合格范围内,阿戈美拉汀长效注射剂稳定性较好。

2.6释放机制

根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则9031缓释控释和迟释制剂指导原则,分别采用Zero-order,First-order和Higuchi模型对释放曲线进行拟合,来研究药物从长效制剂中的释放机制,拟合结果见表2。

表2阿戈美拉汀长效注射剂拟合不同释放模型的相关系数

表2中,Q代表药物在t时刻的累积释放率;k0、k1、k2为系数,由不同释放模型得到的相关系数结果可知,阿戈美拉汀长效注射剂的药物释放最为符合的是Higuchi模型,药物主要由扩散机制释放。

3、讨论

a.含量测定时,阿戈美拉汀易溶于多种有机溶剂,但PLGA/PLA只易溶于乙腈、二氯甲烷和氯仿等少量有机溶剂,同时考虑两者的溶解特性,选用乙腈作为溶剂破坏微粒来测定药物含量。

b.长效注射剂能保证2个月以上的稳定性,分析原因如下:药物分子与PLA分子间存在氢键相互作用,提高了药物分子在载体中的分散稳定性;稳定剂F68是两亲性的非离子型表面活性剂,具有疏水核心和亲水壳的独特结构[10],疏水基团可以覆盖在微粒表面,亲水基团可以改善微粒的润湿性,防止粒子聚集;冻干后阿戈美拉汀PLA微粒分布在海藻糖形成的疏松的立体网状骨架中,使粒子相互隔开且保证粒子在骨架中分散均匀,不聚集;在制备过程中,随着溶剂的快速蒸发,药物以无定形状态均匀分布在载体基质中,较低的储存温度下,载体分子迁移率非常低[11],限制了药物分子的活动,这也提高了制剂的稳定性。

c.制剂体外释放突释较低原因为:湿法研磨过程对微粒表面的药物进行了强力洗脱,离心浓缩过程又除去了溶解在水中的药物,因此降低了由于表面药物释放形成的突释。

d.本研究中,作者选用PLA作为载体材料,在1个月内药物主要为扩散机制释放,推测后期随着PLA水解形成亲水性片段[12],药物进入溶蚀释放阶段,释放机制会发生变化,后期的释放行为及释放机制有待下一步研究。

张妍,费思洋,唐星,徐晖.阿戈美拉汀混悬型长效注射剂的制备与体外评价[J].沈阳药科大学学报,2020,37(03):216-222+251.