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核苷酸适配体修饰的pH响应明胶纳米粒的制备及其体外抗肿瘤能力

2020-08-13 625 上传者：管理员

摘要：目的：制备核苷酸适配体修饰的pH响应明胶纳米粒,用以靶向递送抗癌药物阿霉素(Dox)至肿瘤细胞,对其进行表征并初步考察其体外抗肿瘤能力。方法：通过二次去溶剂法制备明胶纳米粒,通过点击化学和酰胺反应分别修饰聚乙二醇2000(PEG2000)及核苷酸适配体,并对纳米粒的粒径、电位、稳定性、载药量及药物释放进行评价,同时考察该递药体系对小鼠乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果：该纳米粒粒径为150.6±5.03nm,PDI为0.205±0.4,电位呈近中性,载药量为6.72%±0.51%。在4℃下储存30d,粒径无明显改变;在pH5.0下,24h的药物累积释放量达到89%,是pH7.4下的4.23倍。核苷酸适配体修饰的载药明胶纳米粒对4T1细胞48h的IC50值仅为0.99μg•mL-1,显著低于PEG修饰的载药明胶纳米粒的3.42μg•mL-1,细胞毒性提高3.435倍。结论：核苷酸适配体修饰的pH响应明胶纳米粒的粒径大小适宜、分布均匀,具有良好的pH响应释药能力,能显著提高载阿霉素明胶纳米粒的体外抗肿瘤活性。

关键词：
乳腺癌
二次去溶剂法
明胶纳米粒
核苷酸适配体
肿瘤靶向
药剂学
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纳米技术在研究靶向递药系统的过程中发挥着重要作用,但通过纳米递药系统将药物递送至肿瘤组织发挥疗效仍存在诸多困难,如无机纳米材料引起的免疫反应、肿瘤部位蓄积效果不佳、药物被困在溶酶体中无法发挥疗效等[1,2,3]。明胶是一种天然蛋白的水解产物,无毒无免疫原性,具有优良的生物相容性,并可对其肽链上羧基和氨基进行修饰以改变其理化性质[4,5]。值得关注的是明胶纳米粒由于能被肿瘤组织富集的金属基质蛋白酶降解,具有实现响应型释药的潜力[6]。用明胶纳米粒包裹金纳米粒递送药物阿霉素,具有较好的肿瘤穿透能力和抗肿瘤疗效[7]。因此,明胶纳米粒已被广泛用于医药领域,是一种优良载体[4]。在具有转移能力的肿瘤细胞表面会过表达上皮细胞黏附因子(EpCAM),这有利于肿瘤细胞的转移,被认为是一个理想靶点[8]。单克隆抗体的分子量太大,不易用于递药体系的设计,而核苷酸适配体(AP)具有单克隆抗体的特异性靶向效果,并且具有分子量较小、易修饰、无免疫原性的特点[9]。现选用抗癌药物阿霉素(Dox),将其通过pH敏感的腙键连接至纳米粒表面[10],药物能够在酸性的溶酶体环境中断裂释放进入细胞核充分发挥疗效,避免明胶纳米粒传统载药方式中将药物包裹在明胶中使药物释放不完全的情况发生,并将能特异性靶向至EpCAM的核苷酸适配体(AP,5′-A[2′-F-C]G[2′-F-U]A[2′-F-U][2′-F-C][2′-FC][2′-F-C][2′-F-U][2′-F-U][2′-F-U][2′-F-U][2′-F-C]G[2′-F-C]G[2′-FU]-3′),通过聚乙二醇2000(PEG2000)经点击化学连接至明胶纳米粒表面,构建一种pH响应的肿瘤靶向明胶纳米粒,并考察了该纳米粒的理化性质及体外抗肿瘤能力[9]。

1、实验部分

1.1仪器与试药

紫外分光光度计(美国Thermo);ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国马尔文);10M多功能酶标仪(瑞士Spark)。盐酸阿霉素(Dox,美仑生物);B型明胶(美国Sigma);核苷酸适配体(上海权阳生物有限公司);其余试药均为分要纯。

1.2方法与结果

1.2.1二次去溶剂法制备明胶纳米粒

称取适量的明胶,加入适量蒸馏水,于40℃、300r·min-1搅拌溶解,以1.5mL·min-1的滴速逐滴滴加等体积丙酮至反应液中,静置1min后,轻轻倾去上清,于40℃加热挥干丙酮,加适量蒸馏水,于40℃、600r·min-1搅拌至澄清,调节pH3.0,缓慢滴加丙酮至有淡蓝色乳光出现。缓慢滴加与明胶等摩尔量的戊二醛,搅拌8h。将等摩尔量的甘氨酸溶于适量水中,配制成甘氨酸溶液,逐滴加入反应液中,搅拌30min旋蒸除去丙酮,即得明胶纳米粒(GNP)。

1.2.2载药明胶纳米粒的制备

按文献方法合成肼基修饰的阿霉素(Dox-NHNH2):称取一定量Dox溶解于适量无水甲醇中,逐滴滴加等摩尔的水合肼,避光37℃,于600r·min-1搅拌3d,旋蒸除去溶剂,得到红色结晶。将1mLGNP(约100mg·mL-1)、5mgEDC、2mgNHS溶解在3mL去离子水中,调节pH5.0,室温活化3h,调节pH7.4,加入9.6mgDOX-NHNH2,继续在室温、避光下搅拌24h。以截留分子量(MWCO)为8～14kD的透析袋透析48h,得载药的明胶纳米粒(GDP)。将0.75μL丙炔酸与5mgEDC在2mL去离子水中溶解搅拌3h,加入1mLGNP(约100mg·mL-1),室温搅拌24h,以MWCO8～14kD的透析袋透析48h,即得炔基化的载药明胶纳米粒。

1.2.3核苷酸适配体的修饰

将0.75μL丙炔酸与5mgEDC在2mL去离子水中溶解搅拌3h,加入1mLGNP(约100mg·mL-1),室温搅拌24h,以MWCO8～14kD的透析袋透析48h,即得炔基化的载药明胶纳米粒。称取与炔丙酸等摩尔比的叠氮化聚乙二醇2000(PEG2000),溶解在混合溶剂中[水-DMF(1:1)],加入适量CuSO4与VitC钠盐,反应24h,透析后即得PEG修饰的载药明胶纳米粒(GDPP)。0.012mmolEDC与NHS共同溶解在4mL20mg·mL-1的GDPP溶液中,调节pH5.0,于270r·min-1搅拌30min,调节pH7.0,缓慢滴加10μL的核苷酸适配体溶液(1.65μg·μL-1),室温搅拌8h,以MWCO8～14kD的透析袋透析48h,即得修饰核苷酸适配体的载药明胶纳米粒(GDPA)。

1.2.4明胶纳米粒的理化特性考察

将明胶纳米粒贮备液稀释至约1mg·mL-1,用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定粒径大小(25℃)、粒径分布和Zeta电位(图1)。通过紫外可见分光光度法检测Dox的含量。取盐酸阿霉素配制8.07～40.35μg·mL-1的系列溶液,在最大吸收波长488nm处测定吸光度,建立浓度标准曲线为:Y=0.0185X+2×10-4(r2=0.9999)。精密取适量纳米粒贮备液,滴加少量1mol·L-1盐酸预处理,同法测定吸光度,代入浓度标准曲线计算得贮备液中Dox的浓度,并精密取适量贮备液冻干称重,计算其载药量。各组纳米粒的理化性质见表1。通过二次去溶剂法制备的明胶纳米粒GNP,该纳米粒粒径分布均匀,结构稳定,在对纳米粒表面进行炔基化修饰和载药过程中,纳米粒的粒径始终控制在约125nm,平均分散指数(PDI)一直小于0.25。经化学反应,将PEG2000与核苷酸适配体修饰在纳米粒表面后,由于纳米粒质量的增加,其载药量略有降低,粒径由125nm增至约150nm,PDI仍小于0.25。各组样品的电位均呈电中性,在体内不易与带负电的蛋白聚集,具有较好体内运用潜力。

图1GDPA的粒径分布图(A)和Zeta电位图(B)

表1各组纳米粒的理化性质以及载药量

1.2.5纳米粒的稳定性

将GDPA贮备液稀释至约1mg·mL-1,放置在4℃,每隔5d测定粒径大小和粒径分布。由图2可看出:将纳米粒于4℃储存30d,其粒径几乎不发生改变,PDI虽略有增大但始终在0.3以下,证明制备的明胶纳米粒具有较好的稳定性,也为后续实验提供依据。

图2GDPA在30天内的粒径(A)和粒径分布(B)情况

1.2.6纳米粒响应型释放的考察

分别配制pH7.4和pH5.0的磷酸盐缓冲液,将适量GDPA贮备液稀释为明胶浓度为1mg·mL-1的内液,各取2mL,转入透析袋中(MWCO为10～14kD),并将透析袋放入50mL相应的磷酸盐缓冲液中,于摇床中(37℃、60r·min-1)进行释放考察。分别于0、0.5、1、2、4、6、8、12、24h时取150μL外液,置于96孔板内,并及时向外液中补加相同体积的PBS缓冲液。采用酶标仪检测Dox的荧光强度,计算Dox的释放量。取阿霉素盐酸盐配制5.20～20.21μg·mL-1系列溶液,在激发波长485nm、发射波长590nm条件下同酶标仪测定Dox的荧光强度,建立浓度标准曲线回归方程:Y=3.1555×103X+797(r2=0.9993)。同法测定每个样品,平行操作3次。根据测定数据计算阿霉素的释放度,并按照药物体外释放度随时间变化作图(图3)。结果显示:GDPP与GDPA两种纳米粒的释药行为相似且呈时间依赖性,核苷酸适配体的修饰并未改变其释药特点:在生理条件(pH7.4)下稳定,24h的药物累积释放量仅约20%;在酸性条件(pH5.0)中两组纳米粒在24h的累积释放量均高于80%。GDPA、GDPP在酸性条件(pH5.0)的24h药物累积释放率分别是正常生理条件(pH7.4)下的4.23、3.90倍。结果证明:该纳米粒能够实现pH响应释药,具有降低药物在体内不良反应的潜力。

图3GDPP(A)和GDPA(B)在不同pH磷酸缓冲液中的释药行为

1.2.7细胞毒性实验

用胰酶消化在对数生长期后的4T1肿瘤细胞,加入完全培养基中,加入消化液,反复吹打成单细胞悬液。计数后,按每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中。取一定量Dox、GDPP、GDPA,配制Dox为50μg·mL-1的贮备液,并以50μg·mL-1为最高浓度,设置9个浓度梯度。每个浓度设置3个复孔,平行操作,以不加药的细胞孔作为阴性对照,不含细胞的孔作为空白对照,于37℃、5%CO2孵箱中分别培养48h。随后加入20μL5mg·mL-1MTT溶液,继续培养4h,小心吸出培养基并加入180μLDMSO,于恒温摇床60r·min-1振荡30min,使蓝紫色结晶充分溶解在DMSO中,采用化学发光仪在570nm处测定吸光度。以公式计算相对抑制率,各组的半数抑制浓度(IC50)分别使用SPSS软件拟合计算得到。结果显示:Dox、GDPP、GDPA这3组对4T1细胞的细胞毒性均呈浓度依赖性,且细胞存活率随药物浓度升高而降低(图4)。Dox是一种疏水性较好的小分子药物,通过自由扩散的途径而进入细胞,游离药物Dox组与两个纳米粒组的内吞途径不同,细胞毒性最强。GDPA、GDPP、Dox在48h的IC50分别为0.99±0.0199、3.42±0.06、0.16±0.01μg·mL-1,证明了核苷酸配体的修饰能够显著增强纳米粒的体外抗肿瘤活性,对4T1细胞的细胞毒性是未修饰纳米粒的3.45倍,具有良好的体内抗肿瘤前景。

图44T1细胞与不同浓度的GDPP(A)、GDPA(B)、Dox(C)孵育48h后的细胞存活情况

2、讨论

文中研究选用无免疫原性、生物相容性好的明胶为主要载体材料,构建了纳米递药系统,通过二次去溶剂法制备的明胶纳米粒的粒径大小适宜,分布均匀,在进行核苷酸适配体修饰后,仍然能够在4℃下存放30d,粒径不发生变化,具有较好的稳定性。该纳米粒中的腙键能够在pH5.0条件下断裂,快速释放药物(24h累积释放量达到89%),有利于药物释放逃出溶酶体,从而发挥抗肿瘤疗效,而核苷酸适配体的修饰使纳米粒在4T1细胞中的细胞毒性提高了3.4倍,表现出更显著的抗肿瘤活性,具有良好的体内抗肿瘤前景。

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