血栓性疾病是指血栓形成和血栓栓塞2种病理过程所引起的一类疾病，其发病率和死亡率很高，严重威胁着人类的健康[1]。无论溶栓[2]或介入[3]治疗，实现早期快速的血运重建对于治疗血栓性疾病至关重要[4]。大多数基层医院无法展开介入手术，而静脉溶栓治疗始于20世纪80年代，实施较为容易，且疗效已得到肯定[5]。目前临床上常用的溶栓药物大多为直接的或间接的纤溶酶原激活剂，这些溶栓药的应用主要受限于溶栓时间窗[6]，因此新型溶栓制剂的研发，对于防治血栓栓塞类疾病意义重大。

纳豆激酶(nattokinase,NK)是一种具有强烈纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[7]。与目前常用的溶栓药物相比，NK除具有生产工艺简单、稳定性好、半衰期长、特异性强、溶栓活性高等优点外，其最大的优势在于可以直接溶解纤维蛋白[8]，溶解陈旧性血栓[9]。

鉴于NK在溶解血栓和预防血栓性疾病的发生等方面的突出疗效，近年来将其作为功能性食品和添加剂的产品不断面世[10]。但由于NK口服制剂难以用于病情危急、昏迷、呕吐的患者，因此将其开发成注射剂更有助于药理作用的发挥[9]。然而，虽然NK的安全性较高，但静脉给药时仍存在容易出血的风险，因此亟需制备低毒性的NK注射剂。

从结构上看，NK是一种碱性蛋白酶，其由275个氨基酸残基构成的单链多肽酶，分子量为28kDa，表面有8个赖氨酸残基，等电点(isoelectricpoint,pI)为8.6±0.3[11,12]。当pH<pI时，其带正电，所以可考虑在NK注射液中加入阴离子化合物，通过静电结合，在NK周围形成保护层，起到缓释作用，从而降低NK毒性[13]。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamicacid，γ-PGA)是由L-谷氨酸(L-Glu)和D-谷氨酸(D-Glu)通过肽键结合形成的一种多肽分子，在自然界或人体内能降解成内源性物质Glu，不易产生蓄积和不良反应[14]。γ-PGA的侧链上具有大量的羧基(-COOH),pI为2.22[15]，当pH>pI时，其带负电，易和一些药物结合生成稳定的复合物，是一类理想的体内可生物降解的医药用高分子材料[14,15]。

在本研究中，尝试将NK和γ-PGA通过静电结合的方式制备成NK-γ-PGA复合物，以达到降低NK注射液毒性的目的。

1、材料

1.1仪器

BS124s电子分析天平、PB-10型pH计均来自德国赛多利斯公司；DH-2500电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；TM-1动态灭菌器(沈阳天美达科学仪器有限公司)；Nicomp-380激光粒度测定仪(美国ParticleSizingSystems公司)。

1.2药品与试剂

NK溶液(17.9kU·mL-1，广东双骏生物科技有限公司，批号：150316)；γ-PGA(平均分子量1000kD，山东福瑞达生物科技有限公司，批号：20131213)；琼脂糖(西班牙Biowest，批号：142075)；牛纤维蛋白原(每支90mg，中国药品生物制品检定所，批号：GHSJ-FQPH)；凝血酶(每支500U，珠海经济特区生物化学制药厂，批号：20150402);5%葡萄糖注射液(5%Glu，辰欣药业股份有限公司，批号：1401210821);50%葡萄糖注射液(50%Glu，天津药业集团新郑股份有限公司，批号：1410183)；灭菌注射用水(石家庄四药有限公司，批号：1509063204)；磷酸钠(Na3PO4·12H2O，西陇化工股份有限公司，批号：150309)；磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O，西陇化工股份有限公司，批号：131104)；氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司，批号：7815073107)。

1.3动物

昆明种小鼠18～22g，♂，60只，沈阳药科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2010-0001；新西兰白兔体质量为2.5kg，♂，1只，沈阳药科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2014-0002。

2、方法

2.1NK注射液的毒性考察

NK注射液(10kU·mL-1)的配制：精密移取NK溶液(17.9kU·mL-1)2.80mL于5mL量瓶中，加入0.50mL50%Glu注射液，用灭菌注射用水稀释至刻度，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，即得。

取15只小鼠，随机分成5组(每组3只)，单次尾静脉注射NK注射液，给药剂量分别为150,120,100,80和40kU·kg-1。根据给药剂量调整给药体积。在试验期间，记录小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态以评价NK注射液的毒性。

2.2γ-PGA的毒性考察

γ-PGA溶液(15.0mg·mL-1和30.0mg·mL-1)的配制：分别精密称取γ-PGA粉末30.0mg和60.0mg于2mL量瓶中，用5%Glu溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

取6只小鼠，随机分成2组(每组3只)，单次尾静脉注射γ-PGA溶液(30.0mg·mL-1和15.0mg·mL-1)，给药体积为0.013mL·g-1。在试验期间，记录小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态以评价γ-PGA溶液的毒性。

2.3pH对NK与γ-PGA复合情况影响的考察

2.3.1不同pH的NK注射液和NK-γ-PGA注射液的配制

NK注射液(NK10kU·mL-1,pH5.0,6.0,7.0,8.0)的配制：精密移取NK溶液(17.9kU·mL-1)2.80mL于5mL量瓶中，加入适当体积的NaH2PO4溶液(833mmol·L-1)或Na3PO4溶液(158mmol·L-1)调节溶液的pH分别为5.0,6.0,7.0和8.0，加入0.50mL50%Glu注射液，用灭菌注射用水稀释至刻度，摇匀，即得。

NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1,pH5.0,6.0,7.0,8.0)的配制：精密移取NK溶液(17.9kU·mL-1)2.80mL于5mL量瓶中，加入适当体积的NaH2PO4溶液(833mmol·L-1)或Na3PO4溶液(158mmol·L-1)调节溶液的pH分别为5.0,6.0,7.0和8.0，加入756μLγ-PGA溶液(30.0mg·mL-1)，加入0.50mL50%Glu注射液，用灭菌注射用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2不同pH的NK注射液和NK-γ-PGA注射液的毒性考察

取24只小鼠，随机分成8组(每组3只)，分别单次尾静脉注射NK注射液(NK10kU·mL-1,pH5.0,6.0,7.0和8.0)和NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA4.536mg·mL-1,pH5.0,6.0,7.0,8.0)，给药体积为0.012mL·g-1(即NK的给药剂量为120kU·kg-1，γ-PGA的剂量为54.30mg·kg-1)。在试验期间，记录小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态以评价不同pH的NK注射液和NK-γ-PGA注射液的毒性。

2.3.3不同pH的NK注射液活性对比

分别精密移取150μLpH5.0,6.0,7.0,8.0的NK注射液(10kU·mL-1)于5mL量瓶中，用灭菌注射用水稀释至刻度，摇匀。精密移取上述溶液各10μL，分别滴入纤维蛋白平板的加样孔中，加盖置于37℃恒温箱中孵育18h，使用游标卡尺于平皿背面测量溶圈的垂直两直径(a、b)，计算溶圈垂直两径乘积S(S=a×b)[16]。

2.4γ-PGA浓度对NK与γ-PGA复合情况影响的考察

2.4.1不同浓度γ-PGA的NK-γ-PGA注射液的配制

NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.084,0.300,0.924,4.536mg·mL-1,pH6.0)的配制：精密移取NK溶液(17.9kU·mL-1)2.80mL于5mL量瓶中，加入140μLNaH2PO4溶液(833mmol·L-1)，分别加入14,50,154,756μLγ-PGA溶液(30.0mg·mL-1)，加入0.50mL50%Glu注射液，用灭菌注射用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.2不同浓度γ-PGA的NK-γ-PGA注射液的毒性考察

取15只小鼠，随机分成5组(每组3只)，分别单次尾静脉注射NK注射液(NK10kU·mL-1,pH6.0)和NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.084,0.300,0.924,4.536mg·mL-1,pH6.0)，给药体积为0.012mL·g-1(即NK的给药剂量为120kU·kg-1)。在试验期间，记录小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态以评价不同浓度γ-PGA的NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1,pH6.0)的毒性。

2.5NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)毒性降低的原因分析

2.5.1NK和NK-γ-PGA注射液的配制

NK注射液(200,500U·mL-1)的配制：分别精密移取NK注射液(NK10kU·mL-1,pH6.0)0.10,0.25mL于5mL量瓶中，用5%Glu稀释至刻度，摇匀，即得。

500U·mL-1NK-0.0462mg·mL-1γ-PGA注射液的配制：精密移取NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)0.25mL于5mL量瓶中，用5%Glu稀释至刻度，摇匀，即得。

γ-PGA溶液(0.924mg·mL-1)的配制：精密移取γ-PGA溶液(30.0mg·mL-1)154μL于5mL量瓶中，加入140μLNaH2PO4溶液(833mmol·L-1)，加入0.50mL50%Glu注射液，用灭菌注射用水稀释至刻度，摇匀，即得。

γ-PGA溶液(0.0462mg·mL-1)的配制：精密移取γ-PGA溶液(0.924mg·mL-1)注射液0.25mL于5mL量瓶中，用5%Glu稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.2NK和NK-γ-PGA注射液的体外溶栓作用

家兔心脏采血，装于医用采样管中保存，充N2，添加抑菌剂，于37℃保存4d。

取出管中的血凝块并切割成质量约为0.2g的小块，用5%Glu将其表面洗净，滤纸吸干后精密称重，分别加入至含有1.00mL不同酶活度的NK或NK-γ-PGA注射液的西林瓶中，同时以5%Glu和0.0462mg·mL-1γ-PGA溶液作为空白对照，37℃恒温孵育，分别于0.5,1.0,1.5,2,4,6,8,10,18,24h时取出瓶中血块，用滤纸吸干表面液体，精密称重，根据公式计算各血块的相对溶蚀率

ms-溶解前的血凝块质量(g);mn-溶解过程中不同时间点称取的血凝块质量(g)。

2.6NK-γ-PGA复合物注射液的表征

按照最优处方制备NK-γ-PGA复合物注射液，稀释至适宜浓度，取适量滴于铜载网上，1min后滤纸吸去多余样液，2%磷钨酸溶液进行负染，30s后滤纸吸去余液，晾干，于电镜下观察NK-γ-PGA复合物形态并拍照。

利用Nicomp-380激光粒度测定仪测定NK-γ-PGA复合物的粒径与Zeta电位。

3、结果与讨论

3.1NK注射液的毒性考察

以小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态为指标，对NK注射液毒性考察的结果见表1和图1。

随着给药剂量的降低，小鼠的存活时间延长。150kU·kg-1剂量组小鼠给药后约0.33min死亡；120kU·kg-1剂量组小鼠给药后约9min死亡；100kU·kg-1剂量组小鼠给药后最快138min死亡；而≤80kU·kg-1剂量组小鼠给药后无死亡。

给药剂量不同，小鼠的状态也不同。150kU·kg-1和120kU·kg-1剂量组小鼠给药后出现运动减少、嗜睡、呼吸急促、口鼻流血、抽搐现象；100kU·kg-1剂量组小鼠给药后，未出现口鼻流血；≤80kU·kg-1剂量组小鼠给药后仅出现运动减少、嗜睡、呼吸急促症状。

随着给药剂量的降低，NK对小鼠注射部位的损伤程度减小。当给药剂量为80kU·kg-1时，小鼠尾部有不同程度的坏死；而当给药剂量为40kU·kg-1时，小鼠尾部无红肿及坏死。结果见图1。

表1NK注射液(10kU·mL-1)的毒性考察结果(n=3)

图1NK注射液给药48h后存活小鼠尾部的状态

3.2γ-PGA的毒性考察

以小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态为指标，对γ-PGA毒性考察的结果见表2和图2。当γ-PGA溶液的注射剂量≤390mg·kg-1时，注射后小鼠的状态无异常，且小鼠尾部无红肿及坏死。因为30.0mg·mL-1γ-PGA溶液的黏度较高，注射时阻力较大，所以未考察更高的注射剂量。

表2γ-PGA溶液毒性考察结果(n=3)

图2γ-PGA溶液390mg·kg-1给药48h后存活小鼠尾部的状态

3.3pH对NK与γ-PGA复合情况影响的考察

3.3.1不同pH的NK注射液和NK-γ-PGA注射液的毒性考察

以小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态为指标，对不同pH的NK注射液和NK-γ-PGA注射液毒性考察的结果见表3和图3。除NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA4.536mg·mL-1,pH6.0)组小鼠未死亡外，其他给药组小鼠均在11min内死亡，注射NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA4.536mg·mL-1,pH6.0),48h后小鼠尾部红肿。以上结果表明，NK与γ-PGA在pH6.0时复合得最好。

因为NK和γ-PGA是通过静电作用进行复合的，所以只有当NK带较多的正电荷，γ-PGA带较多的负电荷时，它们才能形成稳定的复合物；反之，当其中一个带电荷偏少时，则不能形成稳定的复合物。NK的pI为8.6±0.3，γ-PGA的pI为2.22，在pH6.0时NK和γ-PGA都带有较多的电荷，因此形成的复合物较稳定，降低不良反应的作用也就更明显。

表3不同pH的NK注射液和NK-γ-PGA注射液的毒性考察结果(n=3)

图3单次尾静脉注射NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA4.536mg·mL-1,pH6.0)48h后存活小鼠尾部的状态

3.4不同浓度γ-PGA的NK-γ-PGA注射液的毒性考察

以小鼠给药后的生存时间、生存状态和注射后48h存活小鼠尾部的状态为指标，对不同浓度γ-PGA的NK-γ-PGA注射液毒性考察的结果见表4和图5。

当NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1,pH6.0)中γ-PGA的浓度为0.084～4.536mg·mL-1时，小鼠的死亡率均为0。给药后小鼠尾部的状态与NK注射液中加入的γ-PGA浓度有关，其可能的原因为，当NK-γ-PGA注射液中γ-PGA的浓度较低时，如0.084和0.300mg·mL-1，给药48h后小鼠的尾部有坏死现象产生，说明仍有大量游离的NK存在；当NK-γ-PGA注射液中γ-PGA的浓度较高时，如4.536mg·mL-1，给药48h后小鼠尾部有红肿现象，推测产生该现象的原因是，γ-PGA的浓度较高时，NK-γ-PGA注射液的黏度较大，注射后部分NK-γ-PGA滞留在给药部位，NK释放导致红肿现象发生；而当NK-γ-PGA注射液中γ-PGA浓度为0.924mg·mL-1时，给药48h后小鼠尾部无明显的红肿及坏死现象，说明此时大部分NK与γ-PGA结合形成了复合物，余下少量的游离NK不足以使小鼠的尾巴坏死，另外，该NK-γ-PGA注射液的黏度适中，注射后不会滞留在尾部，产生红肿现象。

综上，当NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1,pH6.0)中γ-PGA的浓度为0.924mg·mL-1时，减毒效果最好。

表4不同浓度γ-PGA的NK-γ-PGA注射液的毒性考察结果(n=3)

图5单次尾静脉注射NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1,pH6.0)48h后存活小鼠尾部的状态

3.5NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)毒性降低的原因分析

NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)毒性降低的原因可能有2种：(1)γ-PGA的加入降低了NK的活性；(2)γ-PGA与NK结合后，缓慢释放NK。为了阐明NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)毒性降低的原因，采用体外溶栓试验考察NK-γ-PGA注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)中NK的活性变化。

3.6NK和NK-γ-PGA注射液的体外溶栓作用

NK和NK-γ-PGA注射液的体外溶栓结果见图6。NK对血凝块的溶解速率与其酶活度呈正相关。10h时，500U·mL-1NK注射液的相对溶蚀率即达到100%，而200U·mL-1NK注射液仅为69%。对于500U·mL-1NK-0.0462mg·mL-1γ-PGA注射液来说，在0～0.5h内，对血凝块的溶解速率低于200U·mL-1NK注射液；之后其溶解速率快速增加，在0.5～2h内，高于200U·mL-1NK注射液而低于500U·mL-1注射液；2h后与500U·mL-1注射液相当。

以上结果表明，γ-PGA的加入未降低NK的活性，毒性的降低主要是因为其与NK形成了复合物，起到了缓释的作用。

图624h内NK和NK-γ-PGA注射液中血凝块的溶解情况(n=3)

3.7NK-γ-PGA复合物注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)的表征

NK-γ-PGA复合物注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)为澄清透明的溶液，该复合物具有纳米结构，呈球型，外观圆整，粒径均匀。电子显微镜图片见图7。

利用Nicomp-380激光粒度测定仪测定该NK-γ-PGA复合物的粒径为(22.6±5.1)nm(n=3),Zeta电位为(-30.6±2.5)mV(n=3)。

图7NK-γ-PGA复合物注射液(NK10kU·mL-1，γ-PGA0.924mg·mL-1,pH6.0)电子显微镜图

4、结论

相比于目前临床上常用的直接的或间接的纤溶酶原激活剂，NK在治疗血栓栓塞性疾病方面有其独特的优势，但其又有出血的不良反应。为了充分发挥NK的优势，减小其不良反应，笔者制备了一种新型的NK-γ-PGA复合物注射液，并进行了体内外的初步评价，研究结果表明该NK-γ-PGA复合物能够在保证NK活性的同时降低其毒性，具有很大的开发前景，达到了本研究的目的。

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