首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 医学毕业论文 > 药剂学毕业论文 > 维生素E琥珀酸酯修饰的普朗尼克P123胶束的制备及初步研究

维生素E琥珀酸酯修饰的普朗尼克P123胶束的制备及初步研究

2020-08-13 606 上传者：管理员

摘要：目的：制备维生素E琥珀酸酯修饰的普朗尼克P123胶束,用以包载阿霉素,并对其进行表征和体外抗肿瘤活性评价。方法：将维生素E琥珀酸酯修饰的普朗尼克P123接枝聚合物(P123-VES)通过透析法制备包载阿霉素的胶束体系,并对其粒径、电位、载药量、包封率、稳定性、药物释放等进行评价;考察该胶束体系对人乳腺癌MCF-7细胞肿瘤球生长的抑制效果。结果：P123-VES的临界胶束浓度为0.11μg•mL-1;载药胶束的粒径为108.40±0.46nm,PDI为0.210±0.015,电位为-22.2±0.1mV,载药量11.31±0.16%,包封率90.47±1.26%;载药胶束能在室温下稳定储存16d以上;游离阿霉素在8h内的累积释放率达97.34%,而载阿霉素胶束在48h内的释放量仅约40%。对人乳腺癌MCF-7细胞3D肿瘤球的抑制效果为:载阿霉素胶束>阿霉素脂质体>盐酸阿霉素>对照组。结论：文中制备的胶束大小适中且较为稳定,并有较好的体外抗肿瘤效果。

关键词：
乳腺癌
普朗尼克P123
维生素E琥珀酸酯
胶束
药剂学
阿霉素
加入收藏

阿霉素脂质体(DOXil)、紫杉醇胶束(Genexol®-PM)、紫杉醇白蛋白纳米粒(Abraxane)等纳米制剂的成功,证实了纳米级别的给药系统在提高化疗药物的抗癌效果及降低化疗药物的系统毒性方面具有巨大优势[1,2,3,4,5,6]。其中,胶束因其灵活多变且制备简单而备受关注。普朗尼克P123(P123)是一种由聚氧丙烯与聚氧乙烯所构成的嵌段共聚物(PEO-b-PPO-b-PEO),具有低毒性、无免疫原性及良好的生物相容性,因其骨架上含有活性羟基,易于功能化修饰,被广泛用作制备纳米胶束的载体材料。而单纯的P123由于临界胶束浓度较大而难以形成较为稳定的胶束。文献通过双腙键将P123和多西紫杉醇共价连接,制成了较为稳定的胶束,并具有良好的抑制肿瘤生长效果,说明对P123进行疏水修饰有利于形成胶束[7]。维生素E琥珀酸酯(VES)是一种维生素E的类似物,具有较长的脂肪链因而疏水性较强。将聚乙二醇和VES连接,用于吡柔比星的肿瘤传递,制备了较为稳定的胶束体系,并取得了较好的抗肿瘤效果[8]。将VES接枝于壳聚糖上制备了包载紫杉醇的胶束体系,也具有较好的抗肿瘤效果[9]。可见VES可以作为较好的疏水嵌段。研究进一步证实了通过对普朗尼克修饰VES的可行性与优越性[10]。现拟将VES接枝到P123上以降低其临界胶束浓度,从而制备稳定的胶束体系。利用VES与阿霉素形成π-π堆叠作用及协同作用以获得较好的载药量与较好的抑瘤效果。

1、实验部分

1.1仪器与试药

GENESYS型紫外分光光度计(美国安捷伦);RF-6000型荧光分光光度计(日本岛津);ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国马尔文);JEOL型透射电子显微镜(日本电子株式会社)。维生素E修饰的普朗尼克P123接枝聚合物(P123-VES,自制);盐酸阿霉素、CCK-8(大连美仑生物技术有限公司);阿霉素脂质体(DOXil,四川科伦药业股份有限公司馈赠);其余试剂为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1载药胶束的制备

因盐酸阿霉素的亲水性较强,不利于将其有效地包裹于胶束之中,所以将盐酸阿霉素去盐酸化以增强其疏水性。将29mg盐酸阿霉素溶于13.6mL二甲亚砜(DMSO)中,搅拌下滴加21μL3倍当量的三乙胺,滴毕,继续搅拌过夜;离心,取上清液,得阿霉素的DMSO溶液。将P123-VES溶于乙腈之中,使得P123-VES的终浓度为50mg·mL-1。将1.5mL阿霉素的DMSO溶液与420μLP123-VES的乙腈溶液混合,继续搅拌1h后转入透析袋(MWCO=3.5kDa)中,于去离子水中透析过夜,以6×103r·min-1离心10min,取上清液,即得载药胶束VP@DOX。

1.2.2胶束的粒径、电位和外观形态

取新鲜制备的VP@DOX,用ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪测定胶束的粒径大小、粒径分布和Zeta电位。实验测试温度为25℃,每个实验平行重复测定3次,计算胶束粒径和Zeta电位。VP@DOX的平均粒径为108.40±0.46nm,多分散系数(PDI)为0.210±0.015,Zeta电位为-22.2±0.1mV。由图1可知:载药胶束VP@DOX有较好的粒径分布,为均一透明的胶束溶液。据文献报道,10～200nm的纳米体系最利于将药物传递并蓄积于肿瘤组织(EPR效应所致),因此,可以推测该胶束体系有利于药物规避RES的清除,进而提高递送药物在肿瘤组织的富集率[11]。同时,Zeta电位的绝对值越大,粒子间表面的静电排斥力也越大,胶束粒子间相互聚集的情况就越少,胶束粒子的单分散情况就越多,胶束的稳定性也就越好[10],因此,VP@DOX较高的Zeta电位绝对值预示着该胶束体系具有较好的稳定性。将载药胶束VP@DOX用去离子水将胶束样品稀释适当倍数,毛细管取少量胶束溶液滴至铜网表面,静置数分钟,吸去周边多余液体。再滴加适量的磷钨酸溶液于铜网上进行染色,常温染数分钟后吸走残液,自然晾干,用透射电镜(TEM)拍照。VP@DOX为比较规整的球形结构,且分布较均一,无显著的黏连聚集情况。TEM的结果与Zeta电位的结果一致,均说明胶束溶液不易发生明显的聚集。

图1VP@DOX的粒径分布(A)、Zeta电位(B)和透射电镜(C)图

1.2.3胶束的包封率和载药量的测定

取0.5mL新鲜制备的载药胶束VP@DOX于10mL量瓶中,加入甲醇定容,超声5min后,测定阿霉素的含量。胶束的载药量和包封率的计算公式如下:载药量=胶束中所含药物的质量/胶束的总质量×100%;包封率=胶束中被包封药物的质量/胶束中包封与未包封药物的总质量×100%。根据载药量和包封率的计算公式,计算出载药胶束VP@DOX的载药量和包封率(由于所使用的阿霉素是经过脱盐处理的,疏水性较强,故而此处游离的阿霉素只占极少部分,对包封率和载药量的影响较小,可以忽略)。VP@DOX的载药量为11.31%±0.16%,包封率为90.47%±1.26%。

1.2.4P123-VES临界胶束浓度的测定及其丁达尔效应

称取适量芘置量瓶中,以适量丙酮溶解并定容,得50μmol·L-1芘贮备液。制备0.25mg·mL-1的空白胶束,依次将其稀释为100、10、1.0、0.1、0.01、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6μg·mL-1,加入芘贮备液使终浓度为0.5μmol·L-1,搅拌过夜。测定336nm激发波长下,373、392nm发射波长下的荧光强度比值I373/I392。以I373/I392值为纵坐标、LogC为横坐标,用Origin2017绘制散点图,计算得P123-VES的临界胶束浓度为0.11μg·mL-1(图2)。丁达尔效应的观察实验方案如下:制备0.25mg·mL-1的空白胶束,依次将其稀释为100、50、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01μg·mL-1,分别标记为S1-9,用红色激光笔照射,拍摄图片。前6个样品皆可形成光柱,后3个样品与水一样不能形成光柱,说明临界胶束浓度为0.5～0.1μg·mL-1,这与芘荧光法测得的结果(0.11μg·mL-1)相吻合,说明P123-VES的临界胶束浓度较低。由此可推断:P123-VES容易形成胶束,并且具有较好的抗稀释能力。

图2芘荧光法测定P123-VES的临界胶束浓度

1.2.5胶束的稳定性考察

将VP@DOX用PBS(pH7.4)稀释不同倍数,考察该胶束的粒径变化。由图3可知:稀释倍数在1000倍之内,均无明显的粒径急剧变大或者急剧变小的情况,说明该胶束具有较好的抗稀释能力,稀释稳定性较好。取新制备的VP@DOX,测定其粒径,并记作第0天,之后将胶束于室温下储存并每隔一天测定其粒径,连续测定16d后,将结果绘制柱形图。由图4可见:该胶束在室温下可稳定储存至少16d,粒径基本不会发生改变,具有较好的室温存放稳定性。

1.2.6药物的体外释放考察

在37℃恒温摇床中振摇(200r·min-1)进行阿霉素的释放实验。分别取VP@DOX、DOX、DOXil(阿霉素浓度均为250μg·mL-1)各1.0mL,加入释放用透析袋中,每个50mL离心管中加入相应的释放介质40mL,在预定的时间点,取出4.0mL透析袋外部介质,并同时于离心管中补加4.0mL新鲜释放介质,使用荧光分光光度计测定溶出液中的药物浓度,并按照下列公式计算药物的累计释放百分率:Er=(Ve∑1n−1Ci+V0Cn)/mdrug×100%,式中,Er为药物的累积释放量(%);Ve为介质的置换体积(4.0mL);V0为释放介质的体积(40mL);Ci为第i次置换取样时释放液中阿霉素的浓度(μg·mL-1);mdrug为用于释放的载药纳米粒子中药物的质量(μg);n为置换介质的次数。如图5所示:游离药物在8h内的累积释放率已达到97.34%,而胶束在96h内的释放量仅约40%,说明胶束不易渗漏,可能在血液循环中较为稳定,进而将药物输送至肿瘤部位。

图3不同稀释倍数下VP@DOX胶束粒径的改变

图4室温下载药胶束VP@DOX的稳定性

图5盐酸阿霉素、载药胶束VP@Dox和阿霉素脂质体中阿霉素的累积释放曲线

1.2.7胶束的体外抗肿瘤活性评价

称取适量低熔点琼脂糖,加入适量无血清RPMI-1640培养液,置80℃水浴中加热溶解,补足无血清RPMI-1640培养液,使琼脂糖浓度为4%。灭菌后加入96孔板中,每孔50μL,冷却备用。将对数生长期的MCF-7细胞消化后,制成约1×104个·mL-1的细胞悬液,取0.2mL细胞悬液加入琼脂糖包被的96孔板中,轻轻振摇5min后,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。隔天换液,培养至第5天备用。接种后第5天,于显微镜下观察肿瘤球,取大小均匀、圆整致密的肿瘤球进行以下实验:吸出培养基,分别加入供试品溶液DOX、VP@DOX和DOXil(各组阿霉素浓度均为10μg·mL-1)各200μL,每组设6个复孔,以不含药培养基孵育的细胞作阴性对照,于培养箱(37℃、5%CO2)中继续孵育5d,每天以倒置显微镜拍摄记录各组肿瘤球的生长状况(图6),并绘制肿瘤球生长曲线(图7)。肿瘤球体积通过“V=(π×dmax×dmin)/6”计算得到,其中,dmax代表最大直径,dmin代表与其垂直的较小直径。肿瘤球的细胞增长率通过“肿瘤球体积比%=(Vday5/Vday0)×100%”计算得到,式中,Vday5为给药5d后的肿瘤球体积,Vday0为给药前的肿瘤球体积。由图6、7可见:阴性对照组的肿瘤球在第1～5天时迅速增大,到了第5天时,其体积为原来的420.8%±26.9%;而给予VP@DOX、DOXil、DOX的细胞,肿瘤球体积的增长相对缓慢,在第5天时,肿瘤球体积分别为初始体积的169.5%±11.8%、249.3%±23.1%、291.0%±18.2%。即对肿瘤球生长的抑制作用为:VP@DOX>DOXil>DOX>Control,表明载药胶束具有最强的体外抗肿瘤活性。VP@DOX组和DOXil组肿瘤球的生长抑制效果优于DOX组的原因可能是阿霉素的肿瘤穿透效果较差。

图6经不同剂型阿霉素处理后MCF-7肿瘤球的形态(n=6)

图7经不同剂型阿霉素处理后MCF-7肿瘤球的体积(n=6)

2、讨论

普朗尼克P123为两亲性聚合物,但其临界胶束浓度较大,不能形成较为稳定的胶束。而通过疏水嵌段的修饰,可以显著降低其临界胶束浓度,进而形成稳定的胶束。文中试验通过在P123上接枝维生素E琥珀酸酯,将其临界胶束浓度降至0.11μg·mL-1,从而制备粒径适宜(108.40±0.46nm)、分布均匀(PDI=0.210±0.015)、稳定性好的载药胶束。又因为维生素E琥珀酸酯有芳香环结构,可与阿霉素形成π-π堆叠作用,从而获得较高的载药量(11.31%±0.16%)。最终制备的载药胶束对乳腺癌肿瘤球模型有较好的生长抑制作用,说明该胶束体系可用于增强阿霉素治疗乳腺癌的效果。

参考文献：

[1]应晓钢.脂质体阿霉素与表阿霉素在乳腺癌治疗中的疗效及副作用比较[D].杭州:浙江大学硕士学位论文,2018.

[2]翟宏强,丁维明,李桂玲.聚合物胶束注射给药系统的研究进展[J].中国医药生物技术,2015,10(5):441-447.

[3]高会乐,蒋新国.新型药物递释系统的研究进展[J].药学学报,2017,52(2):4-11.

[4]吕凤娇,谢晓兰,许小平.阿霉素纳米粒在小鼠体内释放的模型拟合[J].计算机与应用化学,2013,30(9):1047-1050.

[5]熊慧敏,杨响光,张琳.积雪草苷微乳凝胶的制备与体外透皮研究[J].华西药学杂志,2019,34(1):31-36.

[6]王国伟.响应型电荷反转聚合物基因输送体系和PDX模型肿瘤EPR效应的研究[D].杭州:浙江大学硕士学位论文,2018.

[7]梁艳超.pH敏感型多西他赛-PluronicP123结合物胶束的研究[D].济南:山东大学硕士学位论文,2015.

熊晓丰,易小利,周锐,周瑶,林汐,李秋忆,周洲,黄园.维生素E琥珀酸酯修饰的普朗尼克P123胶束的初步研究[J].华西药学杂志,2020,35(03):244-248.