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大鼠条件性位置回避行为反应受电针刺激的影响及其作用机制

2020-07-24 190 上传者：管理员

摘要：目的探讨电针(EA)刺激对大鼠条件性位置回避(conditioned place avoidance,CPA)行为反应的影响及其可能的作用机制。方法免疫荧光染色法检测正常大鼠前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC)脑区组织中μ-阿片受体和NR1的共表达情况。于大鼠ACC脑区内分别预先微量注射μ-阿片受体拮抗剂CTOP及0. 9%氯化钠(NS)后，经左脚掌皮下注射完全弗氏佐剂(complete Freund adjuvant,CFA)诱导产生慢性炎性疼痛，并与特定环境进行匹配，建立CPA模型，再进行环跳穴位电针(EA)刺激(即CTOP+CFA+EA组和NS+CFA+EA组)，同时设假EA刺激组(EA不通电，即CTOP+CFA+shamEA组和NS+CFA+shamEA组)及对照组(ACC及脚掌均注射NS,EA不通电，即NS+NS+shamEA组)，记录CPA试验的第1、3天各组大鼠在痛侧匹配室停留时间，计算回避分数。将各组大鼠放置50℃热板上，检测EA刺激对大鼠热痛行为反应的影响。Western blot法检测各组大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体及磷酸化NR1(p-NR1)的表达水平。结果 μ-阿片受体与NR1在正常大鼠ACC脑区同一个神经元上共表达。NS+CFA+shamEA组大鼠第3天在痛侧停留时间比第1天显著缩短(P <0. 001)，回避分数比NS+NS+shamEA组显著增大(P <0. 001);NS+CFA+EA组大鼠第3天在痛侧停留时间与第1天相比，差异无统计学意义(P> 0. 05)，回避分数比NS+CFA+shamEA显著减小(P <0. 001)。EA刺激不影响大鼠的热痛行为反应。与NS+CFA+shamEA组比较，NS+CFA+EA组大鼠ACC脑区μ-阿片受体表达量明显增高(P <0. 001),p-NR1蛋白表达量明显降低(P <0. 001)。CTOP可明显逆转EA刺激对CFA诱导CPA反应及ACC脑区μ-阿片受体、p-NR1的表达水平的影响(P <0. 001)。结论大鼠CPA反应可能是由CFA诱导ACC脑区p-NR1水平增高导致的，而EA刺激可通过激活μ-阿片受体来减弱该反应。

关键词：
μ-阿片受体
前扣带皮层
大鼠
完全弗氏佐剂
条件性位置回避
电针刺激
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国际疼痛协会将疼痛定义为：一种与组织损伤或潜在的组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛苦体验，其中痛的情绪情感反应目前被认为是与感觉分辨不同的重要疼痛组成，尤其见于持续顽固性疼痛[1,2]。已知前扣带皮层（anterior cingulate cortex,ACC）是情绪情感环路的重要组成，研究证明，ACC脑区参与疼痛引起厌恶情绪的形成，可通过长期抑制ACC神经元的过度活动来达到抗厌恶情绪的作用[3,4]。相关研究表明，ACC脑区内N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体的激活与疼痛的发生密切相关，而NMDA受体1亚基（1 subunit of NMDA receptor,NR1）是NMDA受体的基础亚型，在发生疼痛过程中发挥重要作用[5,6]。

有研究表明，电针（electroacupuncture,EA）刺激可激活μ-阿片受体起到明显的镇痛效应[7]，研究认为，EA也可缓解伤害性刺激引起的厌恶情绪，但其作用机制尚不明确[8]。近年来，利用福尔马林（formalin）或完全弗氏佐剂（complete Freund adjuvant,CFA）局部注射，结合环境适应诱导的条件性位置回避（conditioned place avoidance,CPA）试验是目前评价动物厌恶情绪使用较广泛的检测手段[9,10,11]。因此，本研究采用慢性炎性痛刺激与特定环境匹配建立的CPA模型，并结合Western blot蛋白检测，探讨EA刺激对大鼠CPA行为反应的影响及其作用机制。

1、材料与方法

1.1主要试剂及仪器

CFA及戊巴比妥钠购自美国Sigma公司；μ-阿片受体拮抗剂CTOP、兔抗μ-阿片受体单克隆抗体（abl34054）及兔抗NR1多克隆抗体（ab17345）购自美国Abcam公司；兔抗磷酸化NR1(p-NR1）多克隆抗体（Ser896）及PVDF膜购自美国Millipore公司；小鼠抗NR1单克隆抗体（32-0500）、AlexaFluor488标记的山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555标记的驴抗兔IgG购自美国Thermo Fisher公司；HRP标记山羊抗兔抗体及BCA蛋白浓度测定盒购自武汉博士德生物工程有限公司；0.9%氯化钠（NS）购自石家庄四药有限公司。

1.2实验动物

清洁级SD大鼠，雄性，3～6月龄，体重250～270 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物许可证号为：SCXK（京）2016-0002。

1.3大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体和NR1共表达的检测

采用免疫荧光染色法。将SD大鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后，取ACC脑区组织样本进行冰冻切片，厚度为30μm，封闭1 h；加入兔抗μ-阿片受体单克隆抗体（1∶200稀释）及小鼠抗NR1单克隆抗体（1∶20稀释），4℃孵育过夜；加入Alexa Fluor555标记的驴抗兔IgG及AlexaFluor488标记的山羊抗小鼠IgG（均1∶500稀释），常温孵育2 h；贴片，封片，用荧光显微镜进行观察，并拍照。

1.4大鼠ACC脑区预先给药

将PE-10管一端连接5μL的微量进样器，另一端连接进药管，管道抽吸NS以排尽空气，使整个管道充满NS，回抽微量进样器，使PE-10管前段形成一个0.5～1μL体积的气泡。分别吸取1μL浓度为20 nmol/μL的μ-阿片受体拮抗剂CTOP及NS，以0.1μL/min的速度注射入大鼠ACC脑区内。

1.5CPA装置的建立

CPA装置为一无顶无底的有机玻璃材质的长盒，用一个可抽取的有机玻璃挡板将长盒平均分成两个室，一室内侧贴有间隔一致的红色水平条带，底部为3 mm×3 mm孔径的网眼钢丝，另一室贴有蓝色垂直条带，底部为6 mm×6 mm孔径的网眼钢丝，由此形成两个独立的匹配室[12]。

1.6 EA刺激对大鼠CPA行为反应影响的检测

第1天，取出挡板，让预先已注射CTOP及NS的大鼠在装置内自由活动10 min，记录在两匹配室停留的时间。第2天，插入挡板，随机将大鼠放置一室活动30 min，该区域即为非条件匹配室，也称为非痛侧，取出大鼠，经左侧脚掌皮下注射0.08 mL CFA，休息2 h；将针灸针扎入大鼠双侧环跳穴位置上，连接电针仪（设定参数：频率10 Hz，电流3 mA，波宽0.1 ms），进行EA刺激（即NS+CFA+EA组及CTOP+CFA+EA组），同时设假EA刺激组（仅进行环跳穴针灸，不通电，即NS+CFA+shamEA组及CTOP+CFA+shamEA组）及对照组（ACC及脚掌均注射NS,EA不通电，即NS+NS+shamEA组），再次将大鼠放入另一个室活动30 min，该区域即为条件匹配室，也称为痛侧。第3天，取出挡板，让大鼠在装置内自由活动10 min，记录在两侧匹配室停留的时间，并计算回避分数（大鼠第3天在痛侧匹配室停留的时间-第1天在该室停留的时间）。

1.7 EA刺激对大鼠热痛行为反应影响的检测

热板温度升至50℃，将各组大鼠放进仪器内，观察并记录第1次舔左侧脚掌或抬起后肢的时间，每只大鼠检测3次，每次间隔10～15 min，取平均值，即热缩足反射潜伏期（paw withdrawal latency,PWL）。

1.8 EA刺激对大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体及p-NR1表达水平影响的检测

采用Western blot法。行为学测试后，取各实验组大鼠及正常大鼠ACC脑区组织样本，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定盒测定蛋白浓度。经10%SDS-PAGE分离蛋白后，TBST洗涤5次，每次5 min，转移至PVDF膜上，用0.3%明胶常温封闭1～2 h；加入兔抗μ-阿片受体单克隆抗体（1∶1 000稀释）、兔抗NR1多克隆抗体（1∶1 000稀释）及兔抗p-NR1多克隆抗体（1∶500稀释），4℃低速孵育过夜；TBST洗涤5次，加入HRP标记山羊抗兔抗体（1∶5 000稀释），常温摇床孵育2 h；用ECL超敏发光液进行曝光检测，以GAPDH为内参。

1.9统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据均采用均值±标准差表示，两不同组间比较采用两独立样本t检验；同一个组前后比较采用配对样本t检验；多个组间比较采用单因素方差分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体和NR1的共表达

正常大鼠μ-阿片受体与NR1在ACC脑区同一个神经元上共表达，见图1。表明两者间存在可相互影响的结构基础。

图1μ-阿片受体和NR1在大鼠ACC神经元上的共表达（标尺：50μm)

2.2 EA刺激对大鼠CPA行为反应的影响

NS+CFA+shamEA组大鼠第3天在痛侧的停留时间比第1天显著缩短（t=7.222,P=0.000），且比NS+NS+shamEA组的回避分数显著增大（t=5.304,P=0.000），表明条件位置回避模型建立成功。NS+CFA+EA组大鼠第3天在痛侧的停留时间与第1天相比，差异无统计学意义（t=0.631,P=0.556），回避分数比NS+CFA+shamEA组显著减小（t=4.932,P=0.000);CTOP+CFA+EA组大鼠第3天在痛侧的停留时间比第1天显著缩短（t=4.031,P=0.01），回避分数比NS+CFA+EA组显著增大（t=3.498,P=0.006），提示EA刺激减弱了大鼠CPA反应，CTOP可逆转EA刺激减弱CFA诱导的CPA反应。CTOP+CFA+shamEA组大鼠第3天在痛侧的停留时间比第1天显著缩短（t=4.526,P=0.006），回避分数与NS+CFA+shamEA组比较，差异无统计学意义（t=0.188,P=0.855），表明拮抗剂CTOP本身不影响大鼠的CPA反应。见图2和图3。

图2各组大鼠在痛侧的停留时间

图3各组小鼠的回避分数

2.3 EA刺激对大鼠热痛行为反应的影响

与NS+NS+shamEA组比较，NS+CFA+shamEA组大鼠PWL值显著减小（t=7.466,P=0.000）；与NS+CFA+shamEA组比较，NS+CFA+EA组及CTOP+CFA+shamEA组大鼠PWL值差异无统计学意义（t分别为0.735和1.134,P分别为0.477和0.281）。见图4。提示EA刺激不影响大鼠的热痛行为反应。

2.4 EA刺激对大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体和p-NR1表达水平的影响

与NS+NS+shamEA组比较，NS+CFA+shamEA组大鼠ACC脑区组织中p-NR1表达量显著升高（F=37.787,P=0.000）；与NS+CFA+shamEA组比较，NS+CFA+EA组μ-阿片受体表达显著升高（F=48.482,P=0.000),pNR1蛋白表达量显著降低（F=32.031,P=0.000）；与NS+CFA+EA组比较，CTOP+CFA+EA组μ-阿片受体表达显著降低（F=11.880,P=0.001),pNR1表达量显著升高（F=11.999,P=0.000）。见图5～图7。

图4各组大鼠的PWL值

图5 Western blot法检测各组大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体和p-NR1蛋白的表达

图6各组大鼠ACC脑区组织中μ-阿片受体的表达水平

图7各组大鼠ACC脑区组织中p-NR1蛋白的表达水平

3、讨论

本实验通过对大鼠左侧后脚掌注射CFA诱导产生持续炎性痛，并置于笼具一侧匹配适应，使大鼠对该侧环境产生疼痛记忆，称为痛侧。行为学结果显示，大鼠在痛侧停留时间与非痛侧相比显著缩短（P<0.05），表明大鼠对痛侧产生了明显的回避反应，与相关文献研究结果一致[12]。

NS+CFA+shamEA组大鼠脚掌注射CFA并与笼具痛侧环境匹配适应后，第3天出现明显的CPA反应，即在痛侧驻留时间明显减少（P<0.001），表现出对痛侧环境的厌恶和回避，而NS+CFA+EA组大鼠未出现明显的CPA反应，表明EA刺激后该现象被明显逆转，且两组第3天的PWL值差异无统计学意义（P>0.05）。即CFA注射大鼠在EA刺激后因伤害性刺激诱发的厌恶情绪减轻，但热痛的感觉分辨未变化，预示致痛物质CFA引起厌恶情绪和痛的感觉分辨是分离共存的两个现象，这也从功能上印证了厌恶情绪和痛感觉分辨是由两条不同的上传通路形成的[13,14]。

有研究表明，谷氨酸是ACC脑区重要的神经递质，其受体被激活与厌恶情绪的形成密切相关。NMDA受体是重要的离子型谷氨酸受体，其激活是产生疼痛的充分条件，NR1是NMDA受体的基础亚型，参与调节NMDA受体功能活性，可通过其自身的磷酸化作用易化突触传递[15,16]，其磷酸化水平的高低直接影响神经元的兴奋性。在大鼠脚掌注射CFA后，伴随着CPA行为反应增强，ACC脑区p-NR1水平也增高，且EA刺激可逆转CFA诱导的CPA反应和pNR1的升高，表明发生CPA反应与ACC神经元p-NR1水平升高密切相关。

有实验表明，ACC脑区注射吗啡可产生明显镇痛效果，而EA刺激能够激活阿片受体，引起脑内吗啡样物质活性升高[17,18]。本研究免疫荧光双标结果显示，μ-阿片受体与NR1受体可在ACC脑区同一神经元上共表达，表明两者之间存在相互影响的结构基础。Western blot检测发现，ACC脑区μ-阿片受体在EA作用下蛋白表达量明显升高（P<0.001),p-NR1的含量下降（P<0.001），表明EA刺激引起脑内阿片类递质的释放，激活了阿片受体，后者激活抑制了p-NR1的水平的升高。在EA刺激前给予ACC脑区一定量的μ-阿片受体拮抗剂CTOP，阻断了EA刺激对CPA反应及p-NR1升高的抑制作用。本实验结果还表明，CTOP+CFA+shamEA组大鼠第3天在痛侧的停留时间比第1天显著缩短（P<0.05），且回避分数与NS+CFA+shamEA组比较，差异无统计学意义（P>0.05），表明拮抗剂CTOP本身不会影响大鼠的CPA反应，Western blot检测结果与行为活动观察结果相符，进一步证实了ACC内注入CTOP是通过影响EA刺激作用而引起CPA的变化。

综上所述，大鼠脚掌注射CFA引起ACC脑区p-NR1水平增高是CPA产生的基础；给予EA刺激，激活了ACC脑区μ-阿片受体，该受体的激活降低了NR1的磷酸化水平，从而逆转了大鼠CPA反应的增强。本研究从动物行为学及分子水平初步探讨了EA刺激减弱CFA诱导大鼠CPA的作用机制，为今后痛相关情绪的研究提供了实验依据。

参考文献：

[9]唐雨龙,张玉秋.前扣带皮层NMDA受体-MAPK-CREB通路参与痛厌恶情绪的分子机制[J].生理学报,2017(5):637-646.

[12]张肖怡,兰坤,冯晓璞,等.痛情绪反应量化方法的探索[J].中国医学创新,2014,11(18):45-48.

杜振莹,侯苗苗,关晓雅,赵欣,李建国,张宇.电针刺激对大鼠条件性位置回避行为反应的影响及其作用机制[J].中国生物制品学杂志,2020,33(07):774-778+787.

基金:国家自然科学基金项目(81371254);山西省“1331工程”重点学科建设计划(XK201708)