首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 儿科论文 > 早产儿论文 > 早产低出生体重儿生后6个月肠道菌群的发育特征

早产低出生体重儿生后6个月肠道菌群的发育特征

2021-04-05 298 上传者：管理员

摘要：目的：探讨早产低出生体重儿生后6个月肠道菌群的变化，为临床实施菌群干预措施提供理论依据。方法：选取2019年8月至2020年2月出生于首都医科大学附属北京妇产医院的早产低出生体重儿94例，分析其出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月和6个月粪便标本中菌群多样性和丰度的变化。结果：从出生当天到生后6个月，早产低出生体重儿肠道菌群OTU值逐渐降低，个体间差异显著缩小。新生儿期肠道菌群在门水平上，出生当天肠道菌群以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和酸杆菌门为主，四种优势菌门占全部菌门的88.2%。生后7d、14d、21d、28d肠道菌群以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门为主，四种优势菌门分别占全部菌门的97.1%、99.4%、99.5%、99.5%。生后3个月和6个月的肠道菌群以放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主，四种优势菌门分别占全部菌门的98.6%、99.4%。在属水平上，出生当天及生后7d、14d肠道菌群以肠球菌、链球菌、罗氏菌和肠杆菌为主，四种优势菌属分别占全部菌属的57.1%、78.2%、75.8%。生后21d和28d以肠球菌、韦荣氏球菌、链球菌和肠杆菌为主，四种优势菌属分别占全部菌属的63.0%、53.7%。而在生后3个月和6个月肠道菌群以双歧杆菌和肠杆菌为主，分别占全部菌群的57.2%、47.2%。结论：从出生到生后6个月，早产低出生体重儿肠道菌群多样性逐渐降低，稳定性逐渐增加；且新生儿期肠道菌群组成与生后3个月和6个月相比存在明显差异。

关键词：
多样性
早产低出生体重儿
相对丰度
肠道菌群
加入收藏

早产低出生体重儿是指胎龄<37周且出生体重<2500g的新生儿。胎龄和出生体重低于正常水平是影响该人群围生期、新生儿期和婴儿期健康的重要因素，是持续存在的公共卫生问题[1]。随着我国全面二孩政策的放开，高龄产妇比例逐年增加，早产儿、低出生体重儿的发生率也相应升高。肠道菌群可影响人体对糖类、蛋白质和脂肪等物质的消化吸收[2]，同时在防御感染、维持和增强肠黏膜屏障、免疫等方面发挥重要作用[3]。肠道菌群的定植和演替是一个复杂的过程，受菌群之间相互作用、菌群与宿主之间相互作用、内外环境的变化等多方面的影响[4]。尤其在生命早期，早产低出生体重儿的肠道菌群受遗传、分娩方式、胎龄、出生体重、喂养方式、环境、疾病、抗菌药物应用以及母亲孕期和分娩情况等诸多因素的影响[5,6,7]。大量研究证实，婴幼儿时期所患的多种疾病如小儿腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎、新生儿喂养不耐受、新生儿败血症、过敏性疾病、系统性炎症反应、孤独症等均与肠道菌群紊乱有密切关系[3,8,9,10]。但目前关于早产低出生体重儿早期肠道菌群发育特征的报道较少，因此本研究通过高通量测序分析的方法对早产低出生体重儿粪便样本中的细菌组成进行检测，旨在阐明早产低出生体重儿在生后6个月肠道菌群的分布特征。

1、资料与方法

1.1研究对象x

详细记录患儿的一般情况、临床症于本院的早产低出生体重儿，共纳入94例。纳入标准：(1)出生体重<2500g且胎龄<37周；(2)出生后即转入新生儿重症监护室住院治疗；(3)产妇无吸烟、酗酒等不良嗜好；(4)产妇分娩后计划在京长期居住；(5)产妇无精神疾病史。排除标准：(1)新生儿存在先天性畸形、苯丙酮尿症、半乳糖血症等遗传代谢病；(2)在随访过程中出现死亡；(3)出生后转院治疗；(4)随访过程中发现手术史。本研究通过医院伦理委员会批准，患儿家长均知情并签署知情同意书。

1.2标本采集

使用带稳定液的粪便采集管动态收集出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月、6个月早产低出生体重儿的粪便，采集花生米大小的新鲜便样，编号后置于-80℃保存。稳定液可确保样本DNA在常温下保存7d不降解。住院的早产低出生体重儿粪便采集完成后立即送至医院实验室，出院早产低出生体重儿的标本由家长采集完成后当天快递到医院实验室，最迟2d送达。

1.3标本处理

(1)DNA提取和PCR扩增：采用CTAB法提取对样本的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，用无菌水稀释至1ng/μl。以稀释后的基因组DNA为模板，使用带Barcode的16sV4区引物，NewEnglandBiolabs公司的Phusion®High-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer和高效高保真酶进行PCR，以确保扩增效率和准确性。(2)PCR产物的混样和纯化：PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。(3)文库构建和上机测序：使用TruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和荧光定量PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。

1.4生物信息学分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据，然后经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据。在经过Tags截取，Tags长度过滤，去除嵌合体序列等的一系列处理后，将Tags序列与物种注释数据库进行比对，检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。利用Uparse软件对所用样本的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，同时选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，以出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，统计各样本的群落组成。

1.5统计学处理

使用QIIME软件和R软件绘制稀释曲线、Alpha多样性指数曲线；通过多变量统计学方法进行主成分分析，使用R软件绘制主成分分析（principalcomponentanalysis,PCA）图。采用MRPP分析组间微生物群落结构的差异。

2、结果

2.1物种多样性曲线

稀释曲线是常见的描述组内样本多样性的曲线。如图1所示，各个时间点的OTU数目均迅速增加，之后曲线趋向平坦，说明测序数据量合理，能够反映各组之间物种的丰富程度，可进行后续试验。

图1物种多样性曲线A、B、C、D、E、F、G分别表示出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月、6个月的样本

2.2OTU分析

出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月、6个月的肠道菌群OTU值分别为4607、1466、1150、1028、992、981、953，出生当天OTU值最高，随着时间推移，到生后6个月肠道菌群的OTU值已明显降低。

2.3物种相对丰度分析

2.3.1门水平分析

早产低出生体重儿的粪便样本共检测出10个菌门，包括厚壁菌门、软壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、身份不明的细菌门、绿弯菌门、梭杆菌门和硝化螺旋菌门。在出生当天，肠道菌群以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和酸杆菌门为主，四种优势菌门占全部菌群的88.2%。生后7d、14d、21d、28d肠道菌群以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门为主，四种优势菌门分别占全部菌群的97.1%、99.4%、99.5%、99.5%。生后3个月和6个月的肠道菌群以放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主，四种优势菌门分别占全部菌群的98.6%、99.4%。按时间点纵向分析，厚壁菌门在全部菌门中所占的比例从出生当天（55.5%）到生后14d逐渐增加，并在生后14d达到高峰（76.0%），从生后14d到生后3个月逐渐下降，而在6个月时略有增加，但在比例上生后3个月（15.0%）和6个月（24.6%）均低于新生儿期。变形菌门在全部菌门中的比例在出生当天（16.0%）之后逐渐下降，到生后14d比例最低（14.0%），之后逐渐增加，到生后6个月达到最高值（35.9%）。放线菌门在出生当天（10.5%）逐渐下降，到生后21d达到最低值（5.0%），之后逐渐增加，在生后3个月和6个月时维持在较高比例（分别为44.6%和37.7%）。见图2。

图2门水平上的物种相对丰度A、B、C、D、E、F、G分别表示出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月、6个月的样本

2.3.2属水平分析

测序分析在属水平上共检测出10个菌属，包括肠球菌、支原体、双歧杆菌、单胞菌属、链球菌、身份不明的肠杆菌、罗氏菌、脲原体、韦荣氏球菌和拟杆菌。在出生当天及生后7d、14d以肠球菌、链球菌、罗氏菌和肠杆菌为优势菌属，分别占全部菌属的57.1%、78.2%、75.8%。生后21d和28d以肠球菌、韦荣氏球菌、链球菌和肠杆菌为优势菌属，分别占全部菌属的63.0%、53.7%。生后3个月和6个月肠道菌群以双歧杆菌、肠杆菌、链球菌和肠球菌为优势菌属，分别占全部菌属的70.0%和60.6%。按时间点纵向分析，肠球菌属在生后7d达到最高值（54.0%），之后逐渐减低，在生后3个月和6个月时维持在较低水平（分别为4.8%和6.6%）。链球菌在出生当天到生后14d逐渐增高，生后14d达到最高值（16.6%），之后比例减低。生后3个月和6个月的链球菌比例均低于新生儿期，肠杆菌和双歧杆菌的比例均高于新生儿期比例。见图3。

图3属水平上的物种相对丰度A、B、C、D、E、F、G分别表示出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月、6个月的样本

2.4β多样性分析

在PCA分析中，出生当天肠道菌群的β多样性个体差异较大，随着时间推移，肠道菌群定植逐渐稳定，个体差异显著缩小，见图4。

2.5各时间点间群落结构差异分析

采用MRPP分析组间微生物群落结构的差异是否具有显著性，结果显示，早产低出生体重儿在出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月的菌群结构之间差异均有显著性（P<0.05），而生后3个月和6个月的菌群结构差异无显著性（P>0.05），菌群逐渐趋于稳定。见表1。

图4β多样性图A、B、C、D、E、F、G分别表示出生当天及生后7d、14d、21d、28d、3个月、6个月的样本

表1各时间点间群落结构差异分析

3、讨论

新生儿从出生开始，肠道菌群就开始进行定植和演替。随着时间的推移，肠道菌群的多样性及丰度不断发生变化。早期肠道菌群的发育是影响早产低出生体重儿生长和发育的重要因素。由于早产低出生体重儿宫内生长时间短，胃肠道发育不成熟，肠上皮黏膜屏障功能较弱，抵御肠道病原体的能力较低，在新生儿重症监护病房住院时间较长等因素，导致其具有独特的肠道菌群演替过程[11]。本研究通过队列研究对早产低出生体重儿生后6个月内肠道菌群的变化特征进行了描述。

本研究观察到出生当天早产低出生体重儿肠道菌群的物种多样性和丰度最高，并随着时间推移逐渐减低。有研究发现，早期经验性应用抗生素治疗可导致肠道菌群的多样性持续性降低，并使早产儿罹患坏死性小肠结肠炎、败血症和死亡的风险增加[5]。TANAKA等[12]发现在停止使用抗生素之后，对肠道菌群仍有持续性的影响。本研究入组的早产低出生体重儿均在新生儿重症监护室住院治疗，平均应用抗生素治疗20d，采用哌拉西林钠他唑巴坦钠、美罗培南、头孢他啶、阿莫西林克拉维酸钾等进行单一或多种抗生素联合治疗。因此考虑早产低出生体重儿生后菌群物种多样性和丰度降低极有可能与其较长时间应用抗生素相关。

PCA分析和各时间点间群落结构的差异分析表明随着年龄增长，早产低出生体重儿的肠道菌群在生后3个月达到相对稳定状态，与文献报道一致[13]。肠道菌群趋于稳定，表明共生菌占据肠道菌群的主导地位，从而可进一步抑制条件致病菌发展为致病菌，并防止致病菌的侵扰。虽然目前对早期健康的肠道菌群并没有一个标准定义，但有研究表明肠道菌群在抗生素治疗、感染等应激条件下表现出相对稳定性是其重要特征[14]。

既往认为新生儿在出生前肠道是无菌的，细菌在新生儿肠道的初次定植是出生时发生的。但近期研究表明，胎儿的细菌定植是在出生前开始的。COLLADO等[15]研究发现，羊水中存在一个以变形杆菌为主的微生物群落。此外，AAGAARD等[16]对胎盘组织进行了宏基因组分析，其结果表明胎盘中存在以软壁菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门为主的微生物群落。本研究发现出生当天软壁菌门和梭杆菌门的比例明显高于其他时间点，分别为4.2%、2.3%，推测软壁菌门和梭杆菌门可能是由母体传递给新生儿，之后又迅速被其他菌门所取代。

本研究结果表明，早产低出生体重儿新生儿期的肠道菌群组成与生后3到6个月时存在明显差异。在门水平上，新生儿期肠道菌群以厚壁菌门和变形菌门为主，而在生后3～6个月时以放线菌门和变形菌门为主；在属水平上，新生儿期的肠道菌群除了生后21d以肠球菌、韦荣氏球菌和链球菌为主外，其余时间点均以肠球菌和链球菌为主，而在生后3到6个月时肠道菌群以双歧杆菌和肠杆菌为主。上述结果反映了早产低出生体重儿的肠道菌群初期以肠球菌和链球菌等兼性厌氧菌为主，后期逐渐被双歧杆菌和拟杆菌等厌氧菌取代的演替过程。双歧杆菌是婴儿肠道正常菌群的优势菌，具有保护肠道屏障功能并抑制过度炎症反应的作用[17,18]。BUTEL等[19]的研究表明，在极低出生体重儿中预防性使用含有双歧杆菌的益生菌可降低坏死性小肠结肠炎的发生率。而HILL等[20]研究发现，正常足月儿在生后7d肠道菌群以双歧杆菌和拟杆菌为主，且这种菌群优势持续约4个月，表明与足月儿相比，早产低出生体重儿肠道双歧杆菌定植及达到优势化的时间晚，增加了潜在致病菌定植的风险。本研究阐述了早产低出生体重儿肠道菌群的变化特征，为进一步实施有效的菌群干预措施，促进正常肠道菌群的建立，减少和阻止致病菌的定植提供了一定的依据。

王艳欣,迟诚,刘瑞霞,阴赪宏.早产低出生体重儿生后6个月肠道菌群的发育特征[J].中国医刊,2021,56(04):432-436.