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子宫内膜异位症患者外周血Treg细胞上TIGIT的异常表达

2024-05-31 24 上传者：管理员

摘要：目的探讨子宫内膜异位症患者外周血调节性T细胞(Treg)上免疫检查点分子T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(TIGIT)和CD226的表达和价值。方法以健康检查者为对照，收集2022年7—12月在复旦大学附属妇产科医院诊断为子宫内膜异位症的患者外周血(疾病组)。采用流式细胞术检测抗凝外周血中Treg及细胞上表面分子CD226和TIGIT的百分含量，并比较两组间的差异。结果子宫内膜异位症患者外周血中的Treg细胞占CD4+ T细胞的百分含量为(7.75±1.94)%,对照组中Treg细胞占CD4+ T细胞的百分含量为(7.15±1.78)%,差异无统计学意义(P>0.05);TIGIT+ Treg细胞在疾病组中的比例为(56.10±7.95)%,在对照组中的比例为(49.94±6.45)%,差异有统计学意义(P<0.01);CD226+ Treg细胞在疾病组中的比例为(46.67±6.96)%,其在对照组中的表达比例为(47.31±6.20)%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血Treg细胞的数量没有显著升高，免疫检查点分子TIGIT在子宫内膜异位症患者外周血Treg细胞上的表达异常升高，而CD226无明显表达异常；TIGIT的异常表达与子宫内膜异位症的发生可能相关，或可用于临床辅助诊断子宫内膜异位症的发生。

关键词：
CD226
T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序
子宫内膜异位症
子宫腔外
调节性T细胞
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子宫内膜异位症是一种常见的炎症性妇科疾病，好发于育龄妇女，主要表现为子宫内膜样组织存在并侵袭于子宫腔外的部位，发病率约为5%～10%,其病因尚未得到完全阐明，但其作为一种慢性炎症性疾病，异位灶局部免疫功能失调已得到一定认可[1];并且该免疫异常状态在外周血的免疫细胞中也有直接反映[2]。调节性T细胞(Treg)是一组抑制炎症免疫过度反应、维持免疫自我耐受和稳态的T淋巴细胞[3],Treg细胞在控制不同免疫过程方面具有重要作用。多项证据表明，子宫内膜异位症患者异位灶病变的生长可能与Treg的调节异常有关[4]。T 细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(TIGIT)是新近发现的免疫共抑制分子[5],多表达于活化的T细胞表面，可在配体CD155和CD112的作用下发挥抑制性的调节作用[6],目前已多有报道其在肿瘤免疫及母胎免疫中发挥抑制免疫效应的作用[7]。CD226是与TIGIT发挥相反功能的共刺激分子，且竞争性结合他们共同的配体，在免疫细胞上多有表达[8]。TIGIT/CD226与CD155组成的免疫检查点分子在肿瘤细胞的迁移和增殖等过程中发挥积极作用[9];同时参与调节细胞免疫的功能[10]。Treg上CD226和TIGIT的表达及异常已在部分疾病中有所报道，而子宫内膜异位症患者中这两个分子在Treg上的表达情况及与疾病的相关性尚未见到报道。因此，希望通过本次研究，为这两个免疫检查点分子在子宫内膜异位症中的表达和辅助诊断价值提供数据支持。

1、资料与方法

1.1 资料来源

本次实验经过复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准，伦理号为妇产科伦审2021-213。收集2022年7—12月在临床上诊断为子宫内膜异位症的30例患者作为疾病组，收集术前检验时患者EDTA-K2抗凝外周血，平均年龄(34.30±3.98)岁，主要异位部位为卵巢和盆腔，且其中20例子宫内膜异位症患者存在痛经现象；同时筛选年龄匹配的33例健康体检者作为对照组，平均年龄为(32.79±3.90)岁，其中有9例成员存在痛经现象。两组研究对象年龄之间无明显差异，但疾病组的痛经比例显著高于对照组，差异有统计学意义(P< 0.001)。排除标准：近2周内有全身使用抗真菌药物或抗生素；3个月使用过性激素类药物；有免疫系统或造血系统疾病、染色体相关疾病的患者；无法获得完整资料的患者。术前抗凝外周血，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll)进行梯度密度离心，取单个核细胞(PBMC)进行后续分析。鉴于本次研究的目标细胞Treg细胞在淋巴细胞中的含量较低且较为脆弱，部分收集到标本当天全血裂红后进行流式分析。

1.2 方法

流式抗体包括：CD3-APC/CY7、CD4 FITC、CD25-PE、CD127-APC、TIGIT-BV421及CD226-BV785购自美国Biolegend公司，其中荧光染料代表的是串联染料别藻蓝蛋白/青色素染料7(allophycocyanin/phycoerythrin-Cy7,APC-Cy7)、藻红蛋白(phycoerythrin, PE)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin, APC)、荧光染料亮紫421(Brilliant Violet 421,BV421)、BV510和BV785;根据操作说明，流式抗体与细胞进行混合染色20 min后，洗涤两次后上机。流式细胞仪为CytoFLEX(Beckman-Coulter, 美国),分析软件为CytExpert。

1.3 统计学分析

采用STATA16和PRISM 5软件进行数据分析与结果作图，连续变量用呈现，比较采用独立样本t检验；非正态分布的数据比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Treg细胞的比较

经过流式图的层层圈门，根据荧光抗体CD3+CD4+CD25+CD127low得到外周血中代表的Treg细胞的比例。疾病组患者外周血中的Treg细胞的百分含量为(7.75±1.94)%,对照组中的Treg细胞的百分含量为(7.15±1.78)%,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 Treg细胞上TIGIT的表达

见图2。

图1 CD3+CD4+CD25+CD127low Treg细胞在疾病组和对照组中的表达

图2 TIGIT+ Treg细胞在疾病组和对照组外周血中的代表性流式图

2.3 Treg细胞上CD226的表达

以Treg细胞为目的细胞圈门，检测CD226阳性细胞占Treg细胞的比例，数据显示CD226+ Treg细胞在疾病组中的比例为(46.67±6.96)%,其在对照组中的表达比例为(47.31±6.20)%,差异无统计学意义(t=0.386,P>0.05)。见图3。

图3 CD226+ Treg细胞在疾病组和对照组中的代表性流式图

3、讨论

子宫内膜异位症复发性高且对女性有严重影响，发病率为5%～10%,与地域分布有一定的关联[11],且有年轻化的表现。目前，对子宫内膜异位症的发生原因有较多研究方向，但是免疫因素在其中发挥不可或缺的作用[12]。异位到子宫以外的内膜基质细胞本应被清除或者不能继续入侵，但局部的免疫环境异常改变，使得异位细胞不能被有效清除，引发子宫内膜异位症的发生[13]。

Treg细胞作为一种调节过度免疫反应的免疫细胞，在异位灶局部的过分表达或者功能异常，可能导致目的细胞效应功能被部分抑制，使得效应细胞如巨噬细胞、NK细胞或者CD8+T细胞等不能有效清除异位内膜细胞。由于疾病的炎症性特点，子宫内膜异位症患者循环系统Treg表达的增加在一定程度上可以反映机体的免疫状态[2]。有学者报道Treg细胞在子宫内膜异位症患者外周血中明显升高，但在异位组织局部无明显改变[2];也有学者在外周血并未发现Treg与健康对照中的区别，但发现在异位局部Treg细胞表达降低且功能异常[3];Khaleque 等则发现进展期的子宫内膜异位症患者比早期患者表达更高的Treg细胞[14]。报道认为外周血Treg数量的增多，是对严重炎症的自我调节反应，为子宫内膜异位症晚期患者异位病变的植入和增殖提供保护环境，也可能是代偿性的增多，具体原因则有待进一步的探讨。而本次研究并未发现Treg细胞在子宫内膜异位症患者外周血中有差异化表达。推测Treg细胞在不同的子宫内膜异位症病变阶段所表达的特点不同，如早期可能有所增加，使得其对NK、CD8+T细胞等功能细胞免疫抑制效应减弱，不能有效清除异位细胞；而发展到后期，Treg会出现代偿性减少；当炎症进行到一定阶段，Treg又会增加，呈现一定的动态表达的特点。

TIGIT是重要的免疫共抑制分子，参与减弱免疫细胞的活化和效应功能，可保护机体发生过度免疫，反映机体的免疫状态，在一定程度上阻碍免疫细胞清除抗原性物质，其在肿瘤免疫和母胎免疫中有高表达[8,15]。而CD226作为与TIGIT有相反功能的共刺激分子，往往与调节免疫平衡和自稳息息相关[16]。目前，尚未有报道显示这两个免疫检查点分子在子宫内膜异位症患者外周血Treg细胞上的表达情况的报道，而在肿瘤免疫中多有报道，而子宫内膜异位症的临床特点和免疫机制也与肿瘤的发生较为相近，因此，我们联想到其可能存在相近的表现和致病机制。在本研究中，与对照组相比，Treg细胞上的CD226表达未显著升高，而TIGIT在子宫内膜异位症患者外周血Treg细胞表面上的表达则显著上调，TIGIT/CD226的比值也同时升高。本研究结果在一定程度上验证了我们的猜想，且为其他同道的后续研究提供了数据基础。

TIGIT被相应配体结合后可以激活受体表达细胞，发挥相应的效应功能。Treg上的TIGIT可以介导Treg细胞更好地发挥免疫抑制作用，使得效应细胞如CD8+ T细胞、NK细胞增殖与活性减弱，使其细胞因子如IFN-γ的产生减少，细胞毒作用下降，清除异常或异位细胞的能力减弱[17]。而CD226则可以拮抗并弱化TIGIT对Treg的效应功能[18],而本次研究中CD226未明显改变。两个分子比值的升高，推测虽然Treg细胞数量暂时未发现改变，但其功能已随着免疫检查点分子的异常而有所改变，以致不能有效保证其他效应细胞有效清除异位细胞。本次实验中未对Treg细胞进行动态监测，也未对Treg与其他免疫细胞的免疫效应作出直接的细胞体外实验，是研究中的不足之处，将在后续的研究中加以改进。

综上所述，外周血Treg细胞的数量没有显著升高，而免疫检查点分子TIGIT在子宫内膜异位症患者外周血Treg细胞上的表达异常升高，而CD226无明显表达异常；TIGIT的异常表达与子宫内膜异位症的发生可能相关，或可用于临床辅助诊断子宫内膜异位症的发生。

基金资助:国家自然科学基金(82102469);

文章来源:李翠,段忠亮.子宫内膜异位症患者外周血Treg细胞上TIGIT的异常表达[J].中国妇幼保健,2024,39(11):2067-2070.