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子宫内膜异位症在位内膜上皮类器官模型的建立及鉴定

2024-06-11 64 上传者：管理员

摘要：目的:探讨并验证构建人子宫内膜异位症(EMs)患者在位内膜上皮类器官模型的可行性及影响因素。方法:选择经腹腔镜手术并病理确诊为卵巢型EMs囊肿患者的新鲜在位内膜组织10例，组织消化法将在位内膜消化成单细胞，在基质胶Matrigel中培养7d构建EMs在位内膜上皮类器官模型。通过形态学、免疫组化、HE染色、透射电镜检测等，与原在位内膜组织对比进行模型鉴定；雌激素1、5、10nmol/L干预后观察在位内膜上皮类器官直径的变化，初步探讨雌激素在EMs在位内膜上皮类器官构建中的作用。结果:10例患者在位内膜组织均成功构建EMs在位内膜上皮类器官，光学显微镜下显示在位内膜上皮类器官的数量可观，形态上呈类圆形3D立体结构，周围可见腺体结构；免疫组化显示上皮源性标记物及雌孕激素受体表达阳性属于内膜源性上皮；HE染色显示在高倍镜下构建的在位内膜上皮类器官排列成腺腔样结构但腺体排列稀疏，较不规则，腔体内部分细胞形成分隔与原组织腺上皮结构相似；透射电镜显示在位内膜上皮类器官的内部超微结构与原在位内膜组织具有高度相似性；在培养基中加不同浓度雌二醇，10nmol/L雌激素浓度干预第6d的类器官直径明显大于对照组(P<0.05)。结论:体外成功构建的EMs在位内膜上皮类器官模型具有上皮性特征，与原在位内膜组织对比高度重现来源组织的结构、病理特性，可替代人子宫内膜异位症在位内膜组织用于EMs疾病药物的干预与基础实验的研究的建模。

关键词：
在位内膜腺上皮类器官
妇科疾病
子宫内膜异位症
模型
雌激素
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子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)是一种常见而复杂的妇科疾病，其特征是子宫内膜组织在子宫以外的其他部位生长而引起痛经、不孕等临床症状[1]。目前EMs的发病机制仍尚未明确。Sampson提出的“Retrograde Menstruation Hypothesis”(退行性迁移假说)以及“在位内膜决定论”被认为是EMs发病机制的主要理论之一[2]。探索EMs的病理生理机制和治疗方法在很大程度上依赖于建立理想的细胞模型。EMs基础研究中常见的细胞模型多以间质细胞细胞系为主，而腺上皮细胞的构建困难及原代腺上皮细胞分离后传代次数少且不稳定，限制了基础实验的实施[3,4]。类器官作为新型体外模型，具有长期可扩增性、基因组和转录组稳定性及形成三维结构的能力，显示了原始组织的3D结构和生理学特征[5,6],但目前研究较少。基于“在位内膜决定论”学说，本研究初步探讨构建EMs在位内膜上皮类器官的模型及雌激素浓度梯度对类器官建立的作用，为下一步EMs基础研究及后续利用异位内膜腺上皮构建类器官奠定基础。

1、材料与方法

1.1标本来源

选取于宁夏医科大学总医院行腹腔镜手术的10例EMs在位内膜组织。纳入标准：患者术前月经周期规律；年龄25～40岁；近3个月均未接受过激素类药物治疗；无生殖道炎症及其他妇科疾病；经病理科证实为卵巢型为主的单一或混合型EMs。排除标准：术前3个月内接受过激素药物治疗，患有子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫息肉、子宫内膜非典型性增生、生殖道炎症及其他妇科器质性病变。本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会审批。

1.2试剂

基质胶(美国Corning公司),Advanced DMEM/F12培养基、HEPES、Glutamax、Tryp LE酶(美国Gibco公司),重组人表皮生长因子(epithelial growth factor, EGF)、重组人R-Spondin-1(美国Pepro Tech公司),重组人IGF蛋白、Wnt3a、FGF-10、Nicotinamide、N-actylcysteine、A83-01、Y27632(小分子Rho激酶抑制剂)(美国Bio-Techne公司),B27添加剂(无维生素A,50×)、N2添加剂(100×)(美国Life Technologies公司),糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)抑制剂CHIR-99021[拉度格塞(laduviglusib)],溶组织胶原酶(美国Sigma公司),PBS(中国Viva Cell Biotechnology GmbH公司),细胞角蛋白CK7、E-cadherin、上皮黏附分子EPCAM、ER、PR(美国Proteintech公司),红细胞裂解液、HE染色试剂盒、DAB免疫组化染色试剂盒(中国Solarbio公司)。

1.3实验方法

1.3.1 EMs在位内膜类器官的培养

1.3.1.1在位内膜上皮类器官分离与培养

诊刮法收集在位内膜组织，用PBS溶液清洗，将组织块剪至2～3mm大，转至15mL离心管，PBS清洗3遍，1500r/min离心5min,弃洗液；将组织3倍体积的0.2%溶组织胶原酶加至离心管，混匀。室温吹打消化10min,置37℃、5% CO2孵育箱30min,每隔10min观察组织消化情况并进行吹打，组织消化成白色黏稠絮状，加完全培养基终止消化，1500r/min离心5min,弃上清，加适量体积的基质胶，缓慢重悬底部沉淀，按40μL/孔接种于24孔培养板。将培养板置于细胞培养箱20min,待基质胶凝固，每孔加1mL EMs类器官培养基进行培养，每隔3d换液1次。

1.3.1.2 EMs类器官传代培养

将直径大于200μm的类器官进行1∶2～1∶3传代，置于超净台弃废液，每孔加500μL PBS缓慢清洗3遍，用预冷的枪头将固体混合物刮下，置于冰上缓慢吹打，转移至15mL离心管。1500r/min离心5min,弃上清。加500μL类器官消化液Tryp LE酶，吹打消化5min。轻轻吹打类器官至2～8簇细胞状态，加完全培养基终止消化，1500r/min离心5min,弃上清，加预冷的PBS清洗3遍，离心取沉淀物，接种至新的培养板。根据细胞大小和密度进行传代。

1.3.1.3 EMs类器官冻存与复苏

将上述步骤消化后得到的类器官沉淀按1×103～1×107个细胞重悬于1mL细胞冻存液，转移至细胞冻存管并标记，-80℃过夜，第二天转移至液氮中保存。将冻存的类器官拿出，置37℃水浴锅中不断晃动使其融化。转移至1.5mL离心，弃上清。加适量基质胶重悬类器官沉淀，接种，待基质胶凝固后加入类器官培养基。

1.3.2免疫组化

EMs在位内膜类器官脱胶后加4%甲醛固定，琼脂糖包埋脱水、石蜡包埋，5μm厚度连续切片，65℃烤箱烘片过夜，经脱蜡、抗原修复、一抗孵育(CK7、E-cadherin、EPCAM、ER、PR 4℃过夜)、37℃复温1h、二抗37℃孵育1h、DAB显色、梯度酒精脱水、二甲苯透明等，用中性树胶封片，置于显微镜下拍照观察。

1.3.3 HE染色

EMs在位内膜类器官石蜡切片脱蜡至水，苏木素染液染色5min,自来水冲洗返蓝，分化液分化30s,自来水浸泡15min,置于伊红染液1min,自来水浸泡5min后脱水、透明、中性树脂封片后风干，置于显微镜下观察。

1.3.4透射电镜

收集EMs在位内膜类器官，离心取沉淀，加电镜固定液，4℃重悬混匀固定2～4h,琼脂糖包埋，用1%锇酸避光室温固定2h,室温脱水，渗透包埋，包埋板置于60℃烤箱聚合48h,取出树脂块备用。树脂块于超薄切片机60～80nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片。铜网于2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8min; 70%酒精清洗3次；超纯水清洗3次；2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8min;超纯水清洗3次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.3.5梯度雌激素诱导EMs类器官建立及评估

将EMs在位内膜上皮类器官以2500细胞/孔接种于96孔板，加至类器官培养基，1d后用1、5、10nmol/L雌二醇进行干预，每3d换液1次。干预后第6d,倒置显微镜下拍摄EMs在位内膜类器官。使用Image J软件进行图像分析，测量类器官直径。

1.4统计学处理

采用SPSS23.0和Image J软件。采用单因素方差分析等，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 EMs在位内膜上皮类器官模型的建立与传代

利用3D培养体系构建卵巢型EMs在位内膜类器官模型。体外培养第1d后可见大量不规则类球型结构，随着培养时间增加，类器官数量增多及直径不断增大，呈现大小不一的类球型3D腺腔样立体结构。第7d形成较大的实心及空心的类球型3D立体结构。见图1、2。部分内异症在位内膜类器官周围腺体结构清晰但排列不规则。3例模型构建过程中平均2周后即可进行传代，根据类器官数量及形态大小传代，比例1:3～1:5;传代时将类器官消化成2～8个单细胞簇进行传代时状态最佳。

图1 EMs在位内膜上皮类器官形态学变化

图2 EMs在位内膜上皮类器官的平均直径

2.2 EMs在位内膜上皮类器官的鉴定

HE染色结果显示，EMs在位内膜上皮类器官与原在位内膜在形态学上具有高度相似性，都具有腺体细胞，腺体细胞排列稀疏、不规则，少量腺体分化出腺腔，部分腺腔内少量细胞形成分隔，腺腔出现断裂，部分细胞核形态不一，异型。此类器官上皮细胞质呈淡紫色，细胞核呈深紫色(图3)。

透射电镜结果显示，EMs在位内膜上皮类器官与原在位内膜在超微结构上具有高度相似性，细胞体积相较略大，形状不规则，细胞膜未见明显破损，胞内基质均匀，细胞器数量适中；细胞核(N)近似圆形，以常染色质为主，双层核膜清晰；线粒体(M)略显肿胀，大多膜完整，膜内基质变浅，嵴断裂、减少；粗面内质网(RER)大多略显扩张，局部膜结构略显模糊，表面可见核糖体附着，少量扩张较明显，脱颗粒；脂滴(LD)部分存在，局部聚集；高尔基体(Go)囊膜扩张；胞内可见部分溶酶体(Ly)及少量的自噬溶酶体(ASS)存在的结构特点(图4)。

2.3 EMs在位内膜上皮类器官内膜源性上皮鉴定

上皮细胞标记物EPCAM、CK7、E-cadherin表达阳性，提示EMs在位内膜上皮类器官类器官具备上皮细胞特性(图5);ER、PR抗体表达阳性，提示EMs在位内膜上皮类器官具有此疾病内膜细胞特性(图6)。

图3 EMs在位内膜上皮类器官(×1000)及在位内膜组织的HE染色(×400)

图4 EMs在位内膜上皮类器官及在位内膜组织的透射电镜(×7000)

图5 EMs在位内膜上皮类器官上皮细胞标记物(×400)

2.4雌激素干预在EMs在位内膜上皮类器官中的作用

EMs在位内膜上皮类器官培养基中添加1、5、10nmol/L雌二醇，随着浓度升高，类器官增大，差异有统计学意义(P<0.05)(图7、8)。表明雌激素促进EMs在位内膜上皮类器官的生长作用。

图6 EMs在位内膜上皮类器官细胞雌孕受体的表达(×400)

图7雌激素干预EMs在位内膜上皮类器官(×100)

图8不同浓度雌激素干预EMs在位内膜上皮类器官的直径变化

3、讨论

目前EMs的发病机制尚未明确，其中“在位内膜决定论”被广泛认可，“在位内膜决定论”阐述了异常在位子宫内膜脱落后，通过经血逆流，在腹腔微环境的调节下，在盆腔内植入形成异位病灶，导致EMs的发生发展[7,8]。EMs病变发生的主要细胞成分是上皮细胞和间质细胞[9]。由于EMs在位内膜组织中腺上皮细胞含量少，活性差且不稳定，不能满足基础研究条件[10]。因此，大多数基础研究通过间质细胞株用于研究该疾病的发病机制和药物干预[11,12]。但腺上皮细胞在EMs中扮演着重要的角色，既往研究表明，90%以上女性子宫内膜的上皮祖细胞和间充质干细胞经历了月经逆行，子宫内膜上皮干/祖细胞在月经期间异常地脱落并在雌孕激素的调控下，形成子宫内膜异位植入物[13]。所以构建稳定的在位内膜腺上皮细胞模型对于研究EMs发病机制具有重要意义。

类器官的出现为EMs研究提供了新的模型。典型的类器官是由具有干性的细胞或肿瘤组织构建而成经体外培养的3D微型上皮结构，具有自我更新和自组织能力，重现亲源组织或器官相似的空间结构及功能，用于疾病建模和了解疾病的发展机制。无论源自原发灶还是转移灶类器官，均能表达原始疾病的组织学、生理特性及遗传学特征，也可用于药筛分析，优化患者治疗方案[14,15]。本课题组成功构建了EMs在位内膜腺上皮细胞类器官模型。

本研究提取了10例EMs在位内膜组织进行培养，成功构建出8例能稳定传代的3D立体类圆形细胞，2例不稳定。随机取其中3例进行后续模型鉴定，免疫组化鉴定结果显示培养的类器官具有EMs在位内膜源性上皮细胞的特性。HE染色鉴定结果显示，构建的在位内膜上皮类器官具有圆形及类圆形排列规则或不规则的腺上皮细胞，部分腺上皮细胞包绕形成的腺腔，可见少量的分泌物，与原组织形态学结构上具有高度相似性。超微结构的鉴定结果进一步验证了组织形态学的特征。由此可知，本课题组成功构建出在位内膜上皮类器官，与原组织病理生理特征上具有一致性。EMs组织中雌激素高水平，与健康女性相比，EMs患者月经血中雌二醇(E2)水平更高[16]。本研究结果显示，10nmol/L雌激素可促进EMs在位内膜上皮类器官生长(P<0.05)。表明适量雌激素对构建的内异症在位内膜上皮类器官模型具有促进作用，提高了类器官的培养效率，初步证明了构建在位内膜上皮类器官方法的可行性和有效性。EMs在位内膜上皮类器官的成功构建为下一步构建稳定且足够数量的异位内膜上皮类器官模型奠定了实验基础。

研究发现，影响EMs在位内膜上皮类器官模型构建的重要因素包括组织质地、血运、消化时间及激素水平等。质地较柔软且血运丰富的在位内膜组织构建的在位内膜上皮类器官生长状态较好且数量多。因此，处理新鲜组织时，应置于37℃以下或低温环境下快速完成。培养过程中，浓度梯度雌激素的添加使在位内膜上皮类器官在形态学上没有发生异常变化，适量雌激素在一定程度上也可提高类器官的生长效率，具有一定的有效性。在消化过程中，添加一种小分子Rho激酶ROCK抑制剂，可抑制细胞凋亡，从而提高类器官生长效率。组织充分消化后获得足量细胞是成功构建EMs在位内膜上皮类器官的关键因素之一。但在传代过程中，消化时间的延长会导致类器官状态差甚至培养物丢失。对于难消化的实体型及混合型类器官，可用机械剪切法代替TrypLE消化酶进行分离，从而减少消化时间提高类器官传代效率。

类器官作为器官发育、精准医学、再生医学的革命模型，与临床紧密连接，尽管在临床医学中有许多优点和潜在的应用，但类器官技术仍存一定的局限性，典型的类器官是不包含间质细胞以及其他细胞类型的简单上皮细胞模型[17]。但子宫内膜上皮细胞和间质细胞以及其他因素参与EMs病理和生理的重要交叉对话，并且EMs腺上皮和间质细胞都受到激素的影响[18]。因此，构建腺上皮与间质细胞相互作用的类器官系统是类器官一个重要的挑战。尽管类器官仍存在缺点和技术挑战，但作为精准再生医学最有潜力的模型比二维细胞系在模拟疾病方面更具有准确性。EMs类器官模型为基础研究及个性化医疗发展提供了新的途径。

基金资助:宁夏回族自治区自然科学基金项目(No:2023AAC03589);

文章来源:张瑞琪,杨玉娥,马远,等.子宫内膜异位症在位内膜上皮类器官模型的建立及鉴定[J].现代妇产科进展,2024,33(06):427-432.