蝙蝠草为豆科蝙蝠草属植物蝙蝠草Christia vespertilionis(L. f.) Bahn. f.的全草，又称蝴蝶草、双飞蝴蝶、飞机草、蝴蝶风等，主要分布地为广西、广东和海南等地[1-3]。《黎族药志》《广西植物志》《壮药学》均记载了其归肝经，味甘、微辛，性平，主要功效为清热消肿、通气道，是壮族、瑶族、黎族等少数民族常用的传统草药，可作为茶饮，内服可治疗肺结核，支气管炎，肝炎、扁桃体炎等各种炎症，外敷可疗伤消肿，治疗跌打损伤[1-3]。现代研究表明，蝙蝠草有抗炎[4]、抑菌[5]、抗癌[6-7]、抗氧化、降血糖[8]等作用。课题组前期研究发现，蝙蝠草醇提物可有效拮抗D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭，可有效降低血清炎症因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等水平，有良好的抗炎作用，其机制可能与抑制COX-2/iNOS信号通路有关[4]。在炎症微环境下，大量炎症细胞因子主要由巨噬细胞合成和释放[9]。蝙蝠草醇提物的抗炎作用是否与其抑制巨噬细胞合成和释放炎症细胞因子有关，目前尚未见报道。因此，本实验研究蝙蝠草醇提物对LPS所致巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用，以期为蝙蝠草抗炎的深入研究和临床推广提供实验和理论依据。

1、材料

1.1药物与试剂

蝙蝠草，采自广西崇左市新和镇，经广西中医药大学鉴定教研室滕建北教授鉴定为豆科蝙蝠草属植物蝙蝠草Christia vespertilionis(L. f.) Bahn. f.的干燥全草。胎牛血清(批号2409126CP)购自美国Gibco公司；DMEM高糖培养基、PBS缓冲液(批号20230110、20220725)均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、脂多糖(LPS)(批号401Q039、829Z056、210I031)均购自北京索莱宝科技有限公司；UNlQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒(批号B511321购自生工生物工程(上海)股份有限公司；GeneRuler DNA Ladder Mix(批号B300721)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(批号ER040H440755、ER05X6641381、ER028PD09190)均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；一氧化氮(NO)测定试剂盒(批号20230313)购自南京建成生物工程研究所；活性氧(ROS)检测试剂盒(批号060722230207)购自上海碧云天生物技术股份有限公司；Omni-EasyTM即用型BCA蛋白定量试剂盒、Omni-ECLTM超灵敏化学发光检测试剂盒(批号036B4150、03721150)均购自上海雅酶生物科技有限公司；PVDF膜(R0AB93964)购自德国Merk Millipore公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、NF-κB p65、p-NF-κB p65、核因子κB抑制剂α(IκBα)(活化)、p-IκBα抗体(货号2118S、8242T、3033T、4814T、2859T)均购自美国Cell Signaling Technology公司；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(批号23000721、00104008、20000455)均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2仪器

CO2培养箱(型号C170,德国Binder公司);全波长酶标仪(型号Epoch2,美国BioTek公司);全自动倒置荧光显微镜(型号Axio observer 7,德国Zeiss公司);荧光定量PCR仪(型号QuantStudioTM1 Plus,美国Thermo Fisher公司);高速冷冻离心机(型号5810R,德国Eppendorf公司);倒置生物显微镜(型号CKX53,日本Olympus公司);流式图像细胞计数仪(型号JIMBIO-FIL,江苏卓微生物科技有限公司);垂直电泳仪、蛋白转印模块(型号Mini-PROTEAN Tetra Cell、Mini Trans-Blot Cell,美国Bio-Rad公司)。

2、方法

2.1蝙蝠草醇提物的制备及培养药液的配制

取蝙蝠草，粉碎，过3号筛，称取粉末500 g,置于圆底烧瓶中，加入75%乙醇4 L,回流提取1 h,过滤，药渣继续加入75%乙醇4 L,回流提取1 h,合并2次滤液，置于旋转蒸发仪减压浓缩至流浸膏，采用水浴加热挥干溶媒，即得蝙蝠草醇提物干膏(得膏率为10.57%,1 g相当于原药材9.46 g)。所得干膏粉碎后，添加DMSO超声使充分溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，配制成150 mg/mL的母液，密封避光冷冻保存，使用前融溶，添加培养液稀释至相应浓度用于实验(DMSO与细胞接触的终浓度不超过0.1%)。

2.2细胞培养

RAW264.7细胞培养环境为37℃、5% CO2、饱和湿度，培养液为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，当细胞生长达80%汇合度时，用细胞刮刀刮取使细胞脱落，传代1次。

2.3 MTT法检测细胞存活率

收集对数生长期RAW264.7细胞，以2×105/mL密度种于96孔板，每孔100μL,常规培养24 h后，更换新鲜培养液，加入含不同质量浓度蝙蝠草醇提取物(0、20、40、60、100、120、140、160μg/mL)的培养液，每组设置6个复孔，培养24 h后，每孔添加5 mg/mL MTT溶液20μL,继续孵育4 h后，小心吸弃孔中液体，每孔添加DMSO 150μL,避光振荡8 min,使MTT充分释放溶解。于490 nm波长处测定吸光度(A)值，并计算细胞存活率[10]。公式为细胞存活率=A给药组/A空白组×100%

2.4细胞培养液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平检测

收集对数生长期RAW264.7细胞，以2×105/mL密度种于6孔板，每孔1 mL,常规培养24 h后，除空白组孔内更换新鲜培养液外，其余组孔更换新鲜含LPS(1μg/mL)的培养液，并加入不同质量浓度的蝙蝠草醇提取物(0、20、60、120μg/mL),每组设置3个复孔，作用24 h后，收集各孔内培养液，4 000 r/min离心15 min,取上清液[11]。按试剂盒说明书操作步骤，采用硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO水平，ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.5 DCFH-DA法检测RAW264.7细胞内ROS水平

按照“2.4”项下方法培养和干预细胞，药物干预24 h后，吸弃培养液，PBS润洗2次，加入工作液[DCFH-DA染液(10 mmol/L)和DMEM不完全培养液比例为1∶1 000]1 mL,接触细胞DCFH-DA终浓度为10μmol/L,避光孵育染色20 min, DMEM不完全培养液润洗2次去除未结合的DCFH-DA,于倒置荧光显微镜下拍照，利用Image J软件分析荧光强度，比较细胞内ROS水平。

2.6 RT-qPCR法检测RAW264.7细胞内COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达

按照“2.4”项下方法培养和干预细胞，药物干预24 h后收集细胞，加入总RNA抽提液提取总RNA并检测RNA浓度和纯度，反转录获取cDNA,并稀释5倍，按定量PCR试剂盒说明书要求，使用推荐的20μL扩增体系，在Thermo Fisher QuantStudioTM1 Plus荧光定量PCR仪上机进行反应。PCR扩增条件为95℃预变性3 min, 95℃变性15 s, 60℃退火/延伸30 s,共45个循环。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCT法计算COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA相对表达。引物序列见表1。

表1引物序列

2.7 Western bolt法检测RAW264.7细胞内COX-2、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

按照“2.4”项下方法培养和干预细胞，药物干预24 h后收集细胞，添加含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液300μL,置于冰上振荡裂解30 min, 4℃、12 000 r/min离心25 min,获取总蛋白溶液并采用BCA法检测蛋白浓度。加入5×还原型蛋白上样缓冲液，充分混匀，沸水浴高温变性10 min,经SuperPAGETM预制胶电泳后，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭150 min,将膜置于抗体iNOS(1∶3 000)、COX-2(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000),4℃避光冷藏过夜，TBST室温避光洗膜3次，置于山羊抗兔二抗(1∶3 000)室温孵育60 min, TBST洗膜3次，化学发光显影和定影，凝胶图像分析仪扫描存档，内参为GAPDH,利用Image J软件分析灰度值，计算出iNOS、COX-2、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白相对表达量。

2.8统计学分析

通过SPSS 17.0软件进行处理，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，非正态或方差不齐的数据采用非参数检验分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1蝙蝠草醇提物对RAW264.7细胞存活率的影响

与空白组比较，蝙蝠草醇提物160μg/mL及以下质量浓度作用24 h后，RAW264.7细胞存活率均高于100%,无细胞抑制作用，故后续实验选取蝙蝠草醇提物20、60、120μg/mL,见图1。

3.2蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞培养液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响

与空白组比较，LPS组细胞培养液上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均升高(P<0.01),说明模型复制成功；与LPS组比较，蝙蝠草醇提物20、60、120μg/mL处理24 h后，细胞培养液上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均降低(P<0.05,P<0.01),见图2。

图1蝙蝠草醇提物对RAW264.7细胞存活率的影响

图2蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞培养液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影

3.3蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞内ROS水平的影响

空白组RAW264.7细胞内广泛呈黑色，无荧光染色，仅少量细胞染色，呈微弱淡绿荧光；与空白组比较，LPS组RAW264.7细胞内深染的细胞数目明显增加，呈强绿荧光密集分布，细胞内ROS水平升高(P<0.01);与LPS组比较，蝙蝠草醇提物20、60、120μg/mL处理24 h后，细胞内深染的细胞数目明显减少，荧光染色强度明显减弱，呈微弱荧光散在分布，细胞内ROS水平均降低(P<0.05),见图3。

图3蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞内ROS水平的影响

3.4蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达的影响

与空白组比较，LPS组RAW264.7细胞COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达均升高(P<0.05,P<0.01);与LPS组比较，蝙蝠草醇提物20、60、120μg/mL处理24 h后，细胞COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达均降低(P<0.05,P<0.01),见图4。

图4蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达的影响

3.5蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞COX-2和iNOS蛋白表达的影响

与空白组比较，LPS组RAW264.7细胞COX-2和iNOS蛋白表达均升高(P<0.01);与LPS组比较，蝙蝠草醇提物20、60、120μg/mL处理24 h后，细胞COX-2和iNOS蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),见图5。

3.6蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与空白组比较，LPS组RAW264.7细胞p-IκBα和p-p65蛋白表达均升高(P<0.01);与LPS组比较，蝙蝠草醇提物20、60、120μg/mL处理24 h后，细胞p-IκBα和p-p65蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),见图6。

4、讨论

壮医药是中医药宝贵的组成部分，选择蝙蝠草治疗炎症相关疾病，符合壮医理论“毒虚致病”需“祛毒为先”的治疗理念[12]。范海涛等[13]研究发现，蝙蝠草多糖有良好的自由基清除作用，可促进小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖和吞噬能力。蝙蝠草具有抗炎、抗氧化作用，其清除机体自由基和炎症介质可能是其抗炎的重要机制。

过度的炎症反应会导致机体多组织器官损伤甚至衰竭，而过量炎症介质是过度炎症反应的物质基础[14]。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，也是机体抵御细菌、病毒和真菌等致病原的第一道防线，与炎症的发生发展密切相关。在病原微生物或LPS的刺激下，巨噬细胞过度活化，释放细胞调节因子，包括常见的炎症介质NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等，放大炎症反应，干预多种炎症(如肺炎、胰腺炎、关节炎等)的发生和发展进程[15-16]。

图5蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞中COX-2和iNOS蛋白表达的影响

图6蝙蝠草醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

NO水平的调控被认为是炎症治疗的重要途径，NO也被认为是评判巨噬细胞是否被激活并参与免疫反应的一项重要指标[17]。iNOS的活化可促进NO的释放，而NO是重要的信使分子和促炎介质，可刺激促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β等的释放，并启动机体免疫，引发多种炎症相关疾病[9,17]。COX-2是诱导型COX同工酶，其催化产物可促进NO和促炎因子的释放[15]。ROS是氧自由基、氧化活性物质的总称，正常机体内其产生和清除动态平衡，是维持细胞生长和凋亡正常状态的关键因素，病理状态下，ROS过度积累，动态平衡被打破[9]。在LPS的刺激下巨噬细胞内ROS释放增加，而ROS可降低线粒体膜电位，导致细胞线粒体损伤，影响细胞的有氧呼吸，加速细胞凋亡[9,18]。本研究发现，蝙蝠草醇提物可下调iNOS、COX-2 mRNA和蛋白的过表达，并可降低LPS所致巨噬细胞RAW264.7细胞培养液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平，降低ROS水平，说明蝙蝠草醇提物可能通过清除炎症细胞中的过量ROS,维持线粒体膜电位，对细胞线粒体起到保护作用。

NF-κB信号通路被认为是调节巨噬细胞极化的重要途径，是其炎症反应和炎症治疗的核心所在。p65作为NF-κB核移位的主要亚基，是调控机体免疫、炎症反应和氧化应激的主要核转录因子[19-20]。正常情况下，巨噬细胞细胞质中NF-κB p65、p50和IκB常以三聚体复合物形式存在，该状态不呈现活性，但多种炎症介质如TNF-α、IL-6和IL-1β等可激活NF-κB信号通路，通过起始端信号分子结合膜受体如TLR4受体进行信号传导，激活IKK激酶，促进IκBα的磷酸化[14]。随着磷酸化的IκBα泛素化降解，NF-κB被脱离出来从胞质入核，导致下游基因如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2等过度表达，催生大量NO和促炎因子，机体内NO和促炎因子水平的升高可导致组织DNA损伤，促进炎性渗出和组织水肿，加速炎症疾病的发生和发展[17]。LPS是一种革兰氏阴性菌细胞壁合成和分泌的毒素，也是一种机体免疫反应的启动因子。LPS亦是巨噬细胞强的活化剂，可诱导激活M1型巨噬细胞，释放典型的被激活生物标志物，如TNF-α、IL-6、IL-1β、NO、iNOS和COX-2等，激发强烈的炎症级联反应[21-22]。本研究发现，LPS可激活巨噬细胞RAW264.7,升高细胞培养液NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平，升高ROS水平，激活NF-κB信号通路，上调iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达和COX-2、iNOS、p-IκBα和p-p65蛋白表达，在多种炎症介质的作用下，炎性损伤级联效应被放大，炎症反应剧烈。而蝙蝠草醇提物可减轻LPS所致RAW264.7细胞的炎症反应，下调RAW264.7细胞iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达和COX-2、iNOS、p-IκBα和p-p65蛋白表达，表明蝙蝠草醇提物可能通过调控NF-κB信号通路抑制炎症介质的产生。

综上所述，蝙蝠草醇提物可减轻LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，降低细胞培养液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平，降低细胞ROS水平，下调COX-2、iNOS、p-IκBα和p-p65蛋白表达，其抗炎作用可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。

参考文献:

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[2]戴好富,梅文莉.黎族药志(第一册)[M].北京:中国科学技术出版社,2008:68.

[3]广西植物志编委会.广西植物志(第二卷)[M].南宁:广西科学技术出版社,2005:524.

[4]杨雯琪,朱华,罗静,等.蝙蝠草醇提物对D-GalN/LPS所致小鼠急性肝功能衰竭的影响[J].中成药,2023,45(6):2002-2006.

基金资助:国家自然科学基金项目(82060695);广西重点研发计划项目(桂科AB21196016);广西科技基地和人才专项(桂科AD21238031);广西壮瑶药重点实验室项目(桂科基字[2014]32号);壮瑶药协同创新中心项目(桂教科研[2013]20号);广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心项目(桂发改高技函[2020]2605号);广西中医药重点学科壮药学项目(GZXK-Z-20-64);广西一流学科中药学(民族药学)项目(桂教科研[2018]12号);广西科技重大专项(桂科AA23023035);

文章来源:罗静,朱华,张淼,等.蝙蝠草醇提物对脂多糖所致RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用[J].中成药,2024,46(08):2763-2768.