假性剥脱综合征（PXE）是一种年龄相关疾病，呈明显的地域性分布和种族聚集性，其特征在于眼内和眼外组织中异常纤维物质的产生和慢性积累。PXE通常伴随悬韧带与晶状体异常，容易导致白内障和青光眼等并发症。假性剥脱综合征性白内障（PXEC）进展缓慢，剥脱物质容易阻塞房角，合并症和并发症多，手术风险高[1-2]。目前研究表明，不同国家或种族之间PXEC的发病率存在差异。我国新疆维吾尔族PXEC发病率较高，汉族发病率较低[3]。非标记蛋白质组学是一种通过液相色谱-质谱联用技术对蛋白质酶解产物进行定性定量分析的技术，无需同位素标记[4]。数据依赖采集（DDA）作为其中一种方法，擅长检测复杂样本中的低丰度蛋白，提高定量分析的可靠性。该技术广泛应用于生物医药领域，如药物靶点研究和疾病标志物筛选[5]。动态的房水蛋白质组成的变化，可反映眼内生化过程和周围组织的病理变化，因此眼部疾病的蛋白组学研究常以房水为组织样本[6-7]。运用非标记定量蛋白质组学技术揭示维吾尔族和汉族PXEC患者房水中的蛋白差异，有望为个体化治疗和更精准的医学干预提供新的线索。

1、对象与方法

1.1研究对象

收集2020年6月至2021年1月在和田地区人民医院拟手术治疗的新疆维吾尔族PXEC患者（U组）与在天津医科大学眼科医院拟手术治疗的汉族PXEC患者（H组）房水样本，各6例。纳入标准：根据文献进行临床诊断[8-9]。（1）裂隙灯下瞳孔缘出现明显灰白色小片状剥脱物碎屑。（2）部分或全部色素皱褶缺失。（3）扩瞳后观察到晶体前囊表面附有沉着物。（4）晶状体皮质与核混浊，见图1。排除标准：（1）高度近视。（2）眼部炎性反应。（3）3个月内眼部手术史。（4）高血压、糖尿病等眼底病变。本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》伦理准则，并经过天津医科大学眼科医院伦理委员会审查批准[批文号2020KY（L）-21]。所有受检者均在充分知情的情况下同意参与研究并签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本采集与储存

两组患者均采取常规的超声乳化白内障摘除联合人工晶状体植入术，术中于2点方位行前房穿刺，用1号针头接1 mL针筒借助手术穿刺通道进入前房中部，缓慢抽吸房水至前房开始变浅时停止，约50～100μL，拔出后注射入无菌冻存管，投入液氮中，快速送于-80℃冰箱低温保存。

1.2.2样本制备及纯化

将500μL尿素裂解液（8 mol/L尿素、50 mmol/L NH4HCO3、1×蛋白酶抑制剂）加入样本，室温裂解5 min。样本冰上超声破碎（超声功率35%，总时长2 min），14 000×g离心10 min，取上清液，重复离心确保清洁。使用BCA法（bicin－choninicacid，比色法）测定蛋白浓度，取100μg蛋白。加入10 mmol/L二硫苏糖醇（DTT），37℃孵育1 h，再加入40 mmol/L碘乙酰胺（IAA）避光孵育1 h。样本经10 kD超滤管过滤并纯化3次，加入50 mmol/LNH4HCO3清洗。加入胰酶（3μg），37℃孵育12～16 h，终止酶切后在60℃真空蒸发。样本用0.1%甲酸水重悬，测量蛋白浓度。

1.2.3液相质谱参数

取10μg肽段进行DDA分析。使用ekspertnanoLC 415液相色谱与Triple TOF6600质谱仪。肽段通过C18填料的Trap柱分离，使图1 PXEC裂隙灯显微镜检查Fig.1 Microscopic examination with PXEC slit lamp

1.3质谱数据处理及生物学信息分析

采用Pro－teinPilot软件（版本5.0.1）对DDA数据进行数据库搜索，酶切方式为胰蛋白酶（trypsin），数据库为Uniprot人类数据库，未使用蛋白质评分（unused protScore）>0.05。将搜库结果导入SWATH软件PeakView（版本2.0）进行DIA数据定量，选取每个蛋白6个肽段、每个肽段6个离子转移（transitions），肽段鉴定置信度（confidence）为99%，假发现率（FDR）为1%，峰提取窗口为10 min，质量偏差≤50 ppm，输出峰面积作为定量值。使用R语言的preprocessCore包中的normalize.median函数对原始定量值进行中位数校正，并对转换后的数据进行Log2转换以满足正态分布。通过corrplot包进行主成分分析，去除无基因名称的蛋白质。使用stats包中的t.test函数对蛋白表达进行差异分析，筛选P<0.05且倍数变化绝对值>1.5倍的蛋白作为差异蛋白。利用cluster－Profiler包对GO和KEGG通路进行富集分析，借助STRING数据库分析蛋白互作网络。通过Cytoscape软件的MCODE插件识别关键模块，筛选标准为MCODE评分>10，度截断=2，节点得分截断=0.2，k-核=2，最大深度=100。工作流程图如图2所示。

图2非标记定量蛋白质组学分析工作流程示意图

维吾尔族 汉族 样本收集 蛋白提取蛋白消化酶解ProteinPilot软件分析质谱数据生物学信息分析AB SCIEX Triple TOF 6600上机检测

1.4统计学处理

采用SPSS26.0软件分析，正态分布的计量资料以x±s表示，各组间差异比较采用独立样本t检验。对于非正态分布的计量资料，以中位数（四分位间距）表 示 ，组 间 差 异 采 用Mann -Whitney U检验。计数资料的组间比较采用Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1患者一般资料比较

U组及H组均无其他疾病史。两组年龄、眼压、性别分布差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。

2.2差异蛋白分析

与H组相比，本次蛋白质组学研究共鉴定出差异蛋白123种，其中91种表达下调，32种表达上调。表2仅展示40种代表性差异蛋白，其中包括30种下调蛋白与10种上调蛋白。

2.3数据质控与聚类分析结果

两组患者房水蛋白表达量的主成分分析（PCA，图3）结果显示，各组分蛋白质谱在主成分1（PC1）和主成分2（PC2）方向上存在明显的分离趋势，总贡献率为36.7%，两组蛋白质谱有较明显变化。样本间的皮尔森相关性系数（图4）均达到了0.79及以上。差异蛋白聚类热图显示差异蛋白表达的上下调、不同蛋白间距离的远近和差异蛋白在样本间的重复性（图5）。从热图中可看出每个样本间差异蛋白的表达基本一致，样本间差异蛋白的重复性好。

2.4 GO富集结果

对差异蛋白在生物学过程、细胞组分和分子功能3个方面进行富集分析，分别选取P值最小的前12个结果（图6）。在生物学过程中，差异表达蛋白主要富集于体液免疫应答、肽酶

表1两组患者临床基本信息比较

（x±s）Tab.1 Comparison of basic clinical information between the twogroups（x±s）年龄（岁）性别分布（例数） 眼压男性 女性 （mmHg）U组6/6 71.8±5.8 5 1 15.3±4.6H组6/6 76.5±7.4 1 5 14.1±3.8t/χ2 0.761 3.000 1.018P 0.405 0.083 0.892组别 例数/眼数注：U组：维吾尔族假性剥脱综合征性白内障组；H组：汉族假性剥脱综合征性白内障组；1 mmHg＝0.133 kPa62第1期

表2 U组与H组患者房水中主要差异蛋白的差异比值及表达变化

图3 PCA主成分分析

图5差异蛋白聚类热图

图4皮尔森相关性分析

侧、神经元细胞体等。在分子功能方面，差异表达蛋白主要参与细胞外基质结构成分、肽酶调节活性、糖胺聚糖结合、蛋白酶结合等功能。其中可能参与PXEC的分析结果有：在生物学过程中，簇集蛋白（CLU）、纤维蛋白原 α 链（FGA）、纤维蛋白原 β 链（FGB）、玻连蛋白（VTN）等参与体液免疫应答过程，纤连蛋白1（FN1）、激肽释放酶原1（KNG1）、富组氨酸糖蛋白（HRG）等参与肽酶活性调控，载脂蛋白A-Ⅳ（ApoA4）、载脂蛋白E（ApoE）参与脂代谢调节过程。细胞组分定位中，ApoA4、ApoE、FGA、FGB、纤维蛋白原 γ 链（FGG）、KNG1、HRG、玻连蛋白（VTN）定位于细胞外基质与血液微粒。分子功能中，FGA、FGB、FGG、VTN等分子功能为细胞外基质结构成分，ApoA4、ApoE分子功能为脂质转运体活性。

图6差异蛋白GO富集图

2.5 KEGG富集结果

差异表达蛋白共涉及28条信号通路，其中主要富集于15条通路：补体和凝血级联反应、系统性红斑狼疮、焦点黏连、细胞外基质受体交互、胆固醇代谢等（图7）。其中下调的FGA、FGB、FGG、VTN等参与补体及 凝血级联通路，ApoA4、ApoE参与胆固醇代谢通路。

2.6筛选蛋白互作网络核心蛋白

应用STRING数据库和Cytoscape软件对蛋白互作网络进行可视化和评估，结果如图8A所示。共有115个节点和474个边缘节。运用Cytoscape MCODE插件进行网络计算分析，筛选最显著的模块，该模块包含17种蛋白质（图8B，MCODE得分为12.375）。MCODE插件的分析 结 果 表 明ApoA4具 有 最 高 的MCODE得 分（8.571），较高的度（degree=24），以及较高的中心性（centrality=2.0）。因此确认ApoA4是这一关键模块中的核心枢纽蛋白。

图7差异蛋白KEGG富集图

3、讨论

PXE是一种年龄相关性全身性纤维病变，特征为白色纤维物质在眼部（睫状体、虹膜、晶状体小梁网等眼内部位）以及全身其他组织产生和沉积[10]。其病因受环境和基因复杂的相互作用影响[11]。过去已有来自多个国家及不同种族的研究对PXE、PXEC以及PXEG患者房水蛋白组学进行分析探讨。这些研究结果主要涉及氧化应激反应的增加、潜在的低度炎症、细胞外基质的降解和合成失衡以及细胞自噬功能受损和线粒体功能损伤等方面[6，12-13]。本研究通过非标记蛋白质组学技术筛选出新疆维吾尔族PXEC患者的房水中差异蛋白免疫球蛋白重链 γ3（IGHG3）、免疫球蛋白J链（JCHAIN）、血红蛋白 α链1（HBA1）等31种蛋白表达升高，FGA、ApoA4、ApoE等91种蛋白表达下降。这些差异蛋白涉及氧化应激、炎症、纤维化和细胞外基质、脂质代谢等关键过程。经过Cytoscape软件分析，筛选出MCODE得分最高模块。其中包含ApoA4、ApoE、FGA、FGB、FGG、FN1、补体C4A（C4A）、补体C4B（C4B）、补体C8A（C8A）、淀粉样 β 蛋白前体（APP）、CLU、VTN、KING1、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、HRG、凝血因子XII（F12）、肝素辅因子2（SERPIND1）。ApoA4为PPI网络显著模块中MCODE得分最高的蛋白，表明该蛋白与其他节点蛋白具有密切联系，是这一关键模块中的核心蛋白。KEGG分析显示其与ApoE共同参与胆固醇代谢通路。ApoA4是一种抗氧化糖蛋白，哺乳动物以肠道合成为主，部分由肝脏产生。高密度脂蛋白（HDL）是房水中的主要脂蛋白，ApoA4为HDL的一个成分，与促进胆固醇逆向转运和抗氧化作用密切相关[14-15]。在人体乳糜微粒的脂解过程中，ApoA4通过激活ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）和卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）受体发挥作用，可分别促进胆固醇的外排和酯化[16]。在心血管研究中，胆固醇运输功能受损会导致低密度脂蛋白（LDL）水平升高，促使其在动脉壁滞留、聚集和氧化。巨噬细胞吞噬这些LDL，激活并扩大炎症，从而推动动脉粥样硬化的进程[17-18]。对PXE患眼的晶状体前表面沉积物的质谱分析发现，ApoA4为新鉴定出的剥脱物质的组成成分[19]。研究结果表明，ApoA4与眼前房水屏障功能和房水中的抗氧化作用相关。ApoA4表达下调可能导致房水中的氧化应激和炎症。此外，PXE的患病率受地理特征和环境因素（如温度和阳光照射）的影响[20]。由于地理方面因素差异，海拔高且日照充足的维吾尔族人比汉族人接收更多的紫外线照射，而低剂量长期暴露于紫外线照射是白内障、翼状胬肉和角结膜鳞状细胞癌的风险因素[21]。紫外线照射可导致眼内产生活性氧化自由基，损害蛋白质、核酸和脂类，并随着年龄增长和氧化物积累，导致抗氧化剂活性减弱[22]。因此，紫外线照射对PXEC的发生具有一定的促进作用。研究显示，新疆地区维吾尔族和汉族之间的血脂水平差异显著，维吾尔族表现出较高的LDL和胆固醇水平，而汉族则有较高的甘油三酯水平[23]。这与本次蛋白组学研究中ApoA4和ApoE表达下调结果一致。ApoA4蛋白可能在PXEC的病理过程中发挥着关键调控作用，这为解释两个民族间PXEC的发病率差异提供了线索。纤维蛋白原（FGA、FGB、FGG）由两个相同亚单注：A：由STRING创建的差异表达蛋白的蛋白相互作用网络。圆圈代表蛋白质，线代表蛋白相互作用网络；B：蛋白-蛋白相互作用网络中最显著的模块，有17个蛋白节点与81条连线（由cytoscape软件里的MCODE插件分析得到，MCODE得分为12.375）；PPI：蛋白-蛋白相互作用图8差异蛋白的PPI网络Fig.8 PPI networks of differential proteinsA B殷轲，等.维吾尔族与汉族假性剥脱综合征性白内障患者房水蛋白质组学分析的二聚体组成，每个亚单位由3条多肽链Aα、Bβ和 γ 编码，分别对应FGA、FGB和FGG基因。纤维蛋白原是机体病理急性期的反应物，在机体损伤、血管破裂、感染或与炎症相关的疾病中，血液中的纤维蛋白原浓度可能呈数倍增加[24]。这种异常状态不仅是炎症的指标，也是血管炎症疾病（如高血压、动脉粥样硬化）的高危标志。研究表明，纤维蛋白原及其降解产物在凝血和伤口修复中发挥作用，并通过调节免疫、促进细胞迁移和炎症消退，调控炎症，保护组织并促进修复[25-26]。GO分子功能注释显示，FGA、FGB、FGG参与细胞外基质结构。KEGG通路分析显示，它们富集于补体和凝血级联及血小板激活通路。FGA、FGB、FGG不仅参与PXE的剥脱物质构成，还影响细胞外基质稳态和炎症调节，从而推动PXEC进展及并发症。它们在不同民族患者房水中的表达差异提示炎症调节机制可能存在差异，这为理解PXEC在不同民族中的发病机制提供了证据，强调了炎症的关键作用。

综上所述，本文通过对PXEC患者房水蛋白质组学的研究，探讨了两个不同民族患者之间房水蛋白质成分的变化。17种枢纽蛋白中显著下调的ApoA4以及FGA、FGB、FGG提示在胆固醇代谢与炎症调节反应上，维吾尔族可能与汉族存在不同的生物学特征。本研究使用质谱检测结合生物学信息分析，初步推断出这些蛋白可能参与的分子病理学过程，但由于样本量较少以及缺乏有效的实验模型，差异蛋白的验证仍需进一步研究。

参考文献:

[23]周晓辉,卡比努尔·克依木,李莉,等.新疆维､汉两民族中老年人群血脂水平调查分析[J].心血管康复医学杂志,2009,18(4):317-321.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2020D01A06);天津市医学重点学科(专科)建设项目资助(TJYXZDXK-037A);天津市卫生健康科研项目(TJWJ2023ZD002);

文章来源:殷轲,徐钊,冯强,等.维吾尔族与汉族假性剥脱综合征性白内障患者房水蛋白质组学分析[J].天津医科大学学报,2025,31(01):60-66.